质粒DNA的提取及检测
质粒DNA纯度检测方法及注意事项
质粒DNA纯度检测方法及注意事项确定提取的质粒DNA纯度可以通过以下几种方法：
1.紫外吸收检测：由于核酸和蛋白质的吸收光谱特性不同，可以利用紫外分
光光度计测量DNA样品在260nm和280nm波长下的吸光度值。
纯净的DNA其A260/A280的比值应该接近1.8。
若比值高于1.8，则可能意味着DNA样品中的RNA未完全去除。
比值低于1.8可能说明样品中含有酚类或蛋白质。
同时，如果在270nm存在高吸收，这可能表明有酚的干扰。
2.琼脂糖凝胶电泳：可以使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入EB（溴化
乙锭）染料。
电泳结束后，在紫外灯下观察DNA条带的亮度和清晰度。
纯净的质粒DNA应该显示出清晰、单一的条带。
如果观察到多条带或模糊的条带，这可能意味着样品中存在RNA、蛋白质或其他杂质。
3.荧光分光光度法：对于浓度较低的DNA样品，可以使用荧光分光光度法来
测量DNA的浓度和纯度。
这种方法通常比紫外吸收法更灵敏，可以检测更低浓度的DNA。
需要注意的是，以上方法只能提供关于DNA纯度的间接信息。
为了确保DNA的纯度，最佳的做法是结合多种方法进行分析，并在可能的情况下，通过进一步的实验（如克隆、测序等）验证DNA的质量。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。
质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。
提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。
实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。
步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。
不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。
不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。
步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。
2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
(整理)质粒DNA的提取与检测
质粒DNA 的提取与检测1 概述细菌质粒是一些双链、闭环的DNA分子，其大小范围从1kb至2000kb不等。
已经存在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的遗传单位。
然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。
通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下可能对细菌宿主有利。
由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等。
质粒DNA的复制由负责复制细菌染色体的多种酶来完成，但是不同的质粒在宿主体内所采用的酶迥然不同，而且在宿主中复制的程度也相差悬殊。
一些质粒的拷贝数可高达700个／细胞，而另一些则只能维持在每套宿主细胞染色体仅对应l个质粒分子的最低水平上。
控制质粒拷贝数的基因处于包括DNA 复制起点在内的一个质粒DNA 区域内。
通常情况下，一个质粒只含有一个复制起始区（复制子）。
目前使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒的复制子。
在正常生长条件下，每个细菌细胞中可维持至少15～20个拷贝（带有该复制子的质粒）。
一般认为，这种多拷贝的质粒是以松弛方式进行复制的。
pMB1 复制子的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半寿期较长的酶。
因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够进行。
这样，当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时，带有pMB1复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可以积聚两三千个拷贝。
单向复制从DNA 复制起点开始，由一个RNA 引物所引导，该引物的启动子位于复制起点上游大约550bp处。
新生的RNA与DNA模板形成稳定的杂交体，作为RNA 酶H 的底物，由RNA 酶H 切割从而产生引导DNA 合成的引物。
而RNAⅡ的成熟则由另一个不翻译的RNA小分子（RNA I）所控制。
RNA I编码RNAⅡ的同一区段的DNA 的互补链转录而来，它可与RNA Ⅱ结合，并阻止RNA Ⅱ折叠为三叶草结构，而三叶草结构对于形成稳定的DNA-RNA 杂交体又是必不可少的。
(完整版)质粒DNA提取及浓度纯度测定
质粒DNA提取及浓度纯度测定[实验原理]质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1—200Kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在基本上不防碍细胞的存活，因此质粒是寄主性的自主复制因子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因带进受体细胞表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中D NA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体D NA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0—12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，由于共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子R NA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验中，在EDTA （乙二胺四乙酸）存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）处理使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解，同时细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核酸酶可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液的抽提可以去除蛋白质等。
质粒DNA的提取及检测实验报告
题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
实验七质粒DNA的提取和鉴定
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养 细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒 DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)
选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质 粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的 技术和实验要求
1. 1％Agrose gel的制备 2. 上样 3. 电泳 4. 紫外灯下观察和拍照
思考题
染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？
参考答案
纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质 粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂 成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构， 当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染 色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒 DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构 象
注意
EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带 乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液 洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品， 必须进行清洗或弃去
3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙 基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的 碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧 光。
为什么提取的质粒有三条带？
一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌
种），37℃过夜培养。
2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培
10.50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解（-20℃保存）
酶切鉴定
10μL溶液 + 10×内切酶缓冲液2μL + 5～10U酶到一Eppendorf
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实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分 质粒DNA 的提取
一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器 恒温摇床、台式离心机 2、试剂 溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、 将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、 加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、 加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂，使细胞溶解。
5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。
2.将上清液倒出，保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒DNA的提取和鉴定
是否改变编码区的读框，是否发生两种性质差别较大的氨基酸替代，最好
的方法是测序。 现在有很多生物公司有此项服务，可将菌体或提取的质粒邮寄过去，一个 星期内就可获得测序结果。 可用生物软件Chromas查看测序结果，软件DNAMAN分析序列比对，观看 插入载体的外源片段是否与原基因序列一致。
观看测序结果的软件Chromas
5. 加入150 µl预冷溶液III，盖紧管口，剧烈振荡数次混匀， 冰上放置3min； 12000 rpm离 心5 min，将上清液转至另一 Eppendorf 管中； 6. 加入等体积（400 µl）酚：氯仿溶液，混匀，12,000 rpm室温离心2 min，取上清至另一 新离心管 ； 7. 向上清液加入2倍体积（约800 µl ）无水乙醇，混匀后，室温放置2 min；12000 rpm 离 心5 min。倒去上清液，把 Eppendorf 管倒扣在吸水纸上，吸干液体； 8. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并同上离心，倒去上清液，空气中干燥5～10 分钟；
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；
HIS4为营养缺陷型筛选标志； 3„AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同 源重组； 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表 达载体在 E.coli 中筛选和复制。
根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细 菌内大量复制，得到大量的重组质粒。
琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围
胶浓度（％） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性DNA分子大小（kb） 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3
质粒DNA的提取和鉴定
五、注意事项——材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增 加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加 大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
➢ 菌体量适当。
➢ 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
策
使用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
六、质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
三、实验仪器、材料与试剂
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机 相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： ▪ 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA
作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ▪ 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 ▪ 溶液III 5M KAC
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
质粒dna提取方法
质粒dna提取方法质粒DNA提取是一种常见的实验操作，主要目的是从细菌中提取质粒DNA，以进行后续实验操作，比如质粒转化、质粒测序等。
下面将详细介绍质粒DNA 提取的步骤及方法。
质粒DNA提取的步骤：1. 细菌培养：选择适当的培养基，将所需的细菌接种培养。
培养时间可以根据需要而定，一般为12-18小时。
2. 细菌收获：培养至合适的细菌株数量后，通过离心将菌体沉淀下来。
取出超上清液，保留细菌沉淀。
3. 打断细菌细胞：将细菌沉淀用适当的缓冲液悬浮均匀，加入裂解酶及改性蛋白酶K等酶，使细菌细胞壁及细胞膜打断。
4. 裂解细胞膜：加入裂解液，如碱性SDS溶液或绝对醇等，使细胞膜破裂。
5. 分离细胞核酸：通过盐析法或有机溶剂法，将细胞核酸与其他杂质分离开来。
6. 质粒DNA纯化：使用离心管柱或硅胶膜柱等纯化方法，将纯化后的质粒DNA 获取。
7. DNA沉淀：用乙醇沉淀纯化后的质粒DNA，并通过离心去除沉淀液。
8. 质粒DNA溶解：用适当的缓冲液溶解提取的质粒DNA，并进行质量分析和浓度测试。
以上是一般常用的质粒DNA提取步骤，下面将介绍几种常见的质粒DNA提取方法：1. 碱裂解法（Alkaline lysis）：使用碱性溶液裂解细菌细胞，破坏细胞壁以释放质粒DNA。
该方法简单快速，适用于提取小规模的质粒DNA。
缺点是提取的质粒DNA纯度较低。
2. 硅胶膜柱法（Silica membrane column）：将裂解后的细胞溶液加载到硅胶膜柱上，通过离心和洗涤步骤去除杂质，然后将纯化的质粒DNA洗脱。
该方法纯化效果好，适用于提取高品质的质粒DNA。
3. 盐析法（Salt precipitation）：通过加入高盐溶液使丙酮沉淀蛋白质，并用乙醇沉淀质粒DNA。
该方法适用于大规模质粒DNA提取，但质量稍逊于硅胶膜柱法。
4. 酚-氯仿法（Phenol-chloroform extraction）：将细菌溶解液加入含酚和氯仿的混合溶液中，破坏细菌细胞膜，并使DNA降解酶失去活性。
质粒DNA的提取、纯化和检测
质粒DNA的提取、纯化和检测生命基地班第八组王康 200900140116 一、实验目的（1）掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
（2）掌握碱变性法提取质粒的方法。
（3）学习掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
（4）学习掌握凝胶的制备及电泳方法。
（5）学习掌握凝胶电泳的观察方法，并学会分析。
二、实验原理（1）碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH 值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA 沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
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核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
琼脂糖浓度
0.3
0.6
0.7
0.9
1.21.5Fra bibliotek2.0线状DNA大小/kb
5-60
1-20
0.8-10
0.5-7
0.4-6
0.2-4
0.1-3
核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超 螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链 发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1 条链发生断裂）。
三、实验仪器、材料与试剂
（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋ 可中和DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。
二、实验原理
DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时， 碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电 荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量 的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与 相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大 小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂） ＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。
12000rpm，离心15min
沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）
12000rpm，离心10min 沉淀超净台中风干 沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存
第二部分
琼脂糖凝胶电泳
相关知识
电泳：泳动速度决定于？ 琼脂糖凝胶 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖 （Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组 成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质， 不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生 较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而 影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收， 因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。
二、实验原理
碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在 拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复 中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子 共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不 溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分 子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因 提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。
2686 bp
P(LAC) ORI
ApaLI (1121)
提纯的思路
质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA
凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
第一部分
质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。
四、实验操作步骤
琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. 凝胶板的制备 加样（加样体积在10~30ul） 电泳 染色 结果观察
五、实验结果与讨论
根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况。
自我复制、筛选标记 具有合适的限制酶切位点
高拷贝数、小分子量、高稳定性
质
粒（plasmid）
是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、 环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制 并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基 因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制 酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 松弛型复制（20个以上）
限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 激酶和磷酸酶 核酸外切酶和核酸内切酶 DNA酶和RNA酶 甲基化酶 拓扑异构酶
载 体
特点：
质粒载体：pUC19 、pET21a 噬菌体载体：λ噬菌体载体 M13噬菌体载体 克隆载体：有复制起点 病毒：pCAT3 表达载体：有目的基因 人工染色体：酵母人工染色体 的启动子 （真核生物、原核生物）
三、仪器、材料与试剂
（一） 仪器 （二）材料 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品 （三）试剂 1．5× TBE储液(PH8.0) 使用时稀释 10倍成0.5×TBE （1×TBE也可）。 2．凝胶加样缓冲液 0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成 5ug/ml的EB。
四、实验步骤
接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
ApaLI (1121)
相关知识
基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内， 使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻 译、表达的操作 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细 胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、 受体细胞
常用到的工具酶
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min
质粒DNA的提取及检测
ApaLI (178)
P(BLA)
ApaLI (2367)
ALPHA
EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
2686 bp
P(LAC) ORI
常用的质粒载体
是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700
ApaLI (178)
P(BLA)
ApaLI (2367)
ALPHA
EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分 离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度 大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中 出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA
影响迁移率的因素
DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所 加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电 泳缓冲液的组成。
常用染料
EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐 Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之 间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给 EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在 可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min； 不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出； 可以加到样品中可胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理 才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较 昂贵。