四物汤对辐射小鼠造血功能影响的初步探讨

四物汤对辐射小鼠造血功能影响的初步探讨路晓钦 高 月 刘永学 谭洪玲 马增春(军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室 北京100850)摘 要 目的:对察四物汤对3 5Gy 射线照射小鼠造血系统的影响,探讨四物汤作用机制。

方法:通过外周血象观察、造血祖细胞体外培养、MTT 法检测四物汤及其拆方诱导NIH3T3细胞上清对G-CSF 依赖细胞株NFS-60增殖等指标的影响研究四物汤的作用机制。

结果:四物汤显著升高3 5Gy 射线照射小鼠外周血白细胞、血小板,促进其造血祖细胞CFU-GM 、CFU -meg 、CFU -mix 集落的增殖;四物汤诱导的NIH3T3细胞上清能显著促进G-CSF 依赖细胞株NFS-60细胞的增殖。

结论:四物汤对辐射小鼠造血细胞的作用机制与刺激NIH3T3细胞产生类G-CSF 作用或与G-CSF 产生协同作用而促进外周血白细胞、血小板恢复有关。

主题词 血虚/中医药疗法 四物汤/治疗应用 辐射损伤 造血系统/药物作用 小鼠四物汤由熟地Radix rehmanniae 、当归Ra dix angelicae sinensis 、白芍Radix paeoniae alba 、川芎Rhizoma chuanxiong 组成,具有增强免疫、活血补血等功效,临床上应用广泛。

近年来,国内外学者对四物汤对辐射引起的造血系统的影响进行了初步的研究[1~3]。

但对四物汤在射线照射小鼠造血系统方面的作用机制研究不足,本文观察了四物汤对照射小鼠造血的影响并对其作用机理作了初步探讨。

1 实验材料1 1 实验动物分组 C57BL/6J 小鼠,6~8周龄,体重20 2g ,雌性;由军事医学科学院实验动物中心提供,一级动物饲养室饲养。

将小鼠按体重随机分为3组:正常对照组、模型组、四物汤组。

小鼠常规饲养3~5d 后,60Co 射线全身一次照射,治疗组照后立即灌胃给药,连续7d,每d1次,0 2ml/次(相当于四物汤10g/kg),正常对照组和模型组则给予等体积的生理盐水。

1 2 主要试剂与仪器 RPMI1640,Gibco BRL 公司产品;胎牛血清,马血清,北京军区兽医防治中心提供;G -CSF,日本麒麟株氏会社产品;CO 2培养箱,Napco -5410;酶标仪,Wal lacVic ToR1420,美国产品;自动血球计数仪(日本Sysmex -800);CO 2孵育箱;倒置相差显微镜(AO 公司生产); 剂量辐射检测控制仪(军事医学科学院QT -3型优质OC L)。

1 3 药物及制备 四物汤全部药物均购自北京同仁堂中药厂。

按 太平惠民和剂局方 规定的剂量称取,熟地15g 、当归10g 、白芍10g 、川芎6g,共计41g,经水煎、过滤、浓缩、配制成100%药液(即每ml 药液含生药1g);其它拆方组均按相当于四物汤的量进行拆方分组,按同样的方法制备成相当于四物汤浓度的药液,置4 保存备用。

体外实验将过滤除菌的四物汤药液倍比稀释成不同浓度,加入到细胞培养体系中。

1 4 细胞系 NIH3T3细胞为小鼠胚胎期成纤维细胞(本院放射医学研究所实验病理研究室惠赠),用含8%胎牛血清的RPMI1640培养液按贴壁常规培养;NFS-60细胞为G -CSF 依赖的小鼠源性粒系白血病细胞株(本院放射医学研究所放射病治疗研究室惠赠),含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,加入G-CSF 至终浓度为10ng/ml,隔天换液1次。

2 实验方法2 1 外周血象检测 各组动物(按体重及外周血象随机分组,每组10只)分别于制模前、制模后1、3、5、7、9、11、13、17、21d,每只实验小鼠尾静脉取血20 l,用Sysmex -800自动血球计数仪检测外周血象。

2 2 造血祖细胞培养 照射后第7d,各批次活杀3只小鼠,无菌条件下取股骨,用RPMI1640培养液冲出骨髓细胞,过4号针头制成单细胞悬液,计数有核细胞,并计算出接种细胞悬液量,使其于培养体系中的有核细胞浓度为1 105/ml 。

参照刘秀珍[4]介绍的方法并稍加改动,检测粒系(CFU -GM)、巨核系(CFU-meg )祖细胞集落。

2 3 NFS-60细胞生长曲线的测定 将指数生长期的NFS -60细胞用RPMI1640培养液洗涤3次,血球计数仪计数细胞,然后用含5%胎牛血清的RPMI1640培养基调整NFS-60细胞浓度为8 108/ml,每孔50 l 加入96孔板中;G -CSF 因子以上述培养基3倍递减稀释后,每孔加50 l,每组做6个复孔,在37 ,5%CO 2孵箱中培养2d,培养终止前4h 加入MTT (5mg/ml)20 l,在37 ,5%CO 2孵箱中继续培养4h 后弃上清,加入200 lDMSO,振荡助溶,在酶标仪上置490nm 波长处测OD 值。

以造血因子浓度为横坐标,以OD 值为纵坐标绘制生长曲线。

2 4 四物汤及其拆方条件培养液的制备及对NFS-60细胞增殖影响的测定 计数指数生长期NIH3T3细胞,加入四物汤并用培养液调整细胞浓度为5 104/ml 、药物终浓度分别为32、16、8、4、2、1、0 5、0mg/ml,置培养瓶中;在37 5%CO 2孵箱中培养3d,取上清备用;将指数生长期的NFS-60细胞用RPMI1640培养液洗涤3次,计数并用含5%胎牛血清的RPMI1640调整其浓度为1 106/ml;在96孔平底板上每孔加50 l 诱生上清、50 lNFS-60细胞悬液,每组设12个复孔,按上法在490nm 波长处测OD 值。

各拆方组药物以相当于四物汤为4mg /ml 的浓度测定对NFS-60细胞增殖影响。

2 5 统计学处理 各组实验数据以均值 标准差( x s)表示。

两组间的差异显著性分析用t 检验。

3 结果216 中国中医药科技2002年第9卷第4期3 1 四物汤对照射小鼠外周血象的影响如图1所示,照后第5、7、9、11d 四物汤组白细胞数明显高于对照组,具有统计学差别;进一步分析表明,四物汤组白细胞数恢复至50%的时间比对照组提前了4d,且其它各检测时间点均比对照组有所提高。

图1 四物汤对3 5Gy 照射小鼠外周血白细胞的影响如图2所示,四物汤组照后血小板数在各检测时间点上均比照射对照组为高,且在照后第1、5d有显著性差异。

图2 四物汤对3 5Gy 照射小鼠外周血血小板的影响3 2 四物汤对照射小鼠造血祖细胞集落的影响小鼠在受到3 5Gy 照射后,C FU-GM 、CFU -meg 、CFU-mi x 集落的形成能力降低。

用四物汤治疗后,CFU -GM 、CFU -meg 集落数明显回升,与照射对照组相比有显著性差异。

表1四物汤对照射小鼠造血祖细胞集落的影响( x s,n=6)组别C FU-GM CF U-m eg C F U-mi x 正常组629 80 14 24***15 50 3 42***23 50 5 20***照射对照组62 80 7 401 25 0 53 75 1 26SW T 组177 60 10 55***9 00 2 58**19 50 2 98*** 与照射对照组比较*P<0 05,**P<0 01,***P<0 0013 3 NFS-60细胞的G-CSF 剂量依赖生长曲线图3所示NFS-60细胞的生长曲线与文献相同[5],证明本细胞株对G-CSF 因子的依赖性。

3 4 四物汤诱生NIH3T3细胞上清对NFS-60细胞增殖的影响图4所示低浓度四物汤诱生NIH 3T3细胞上清对NFS-60细胞有促增殖作用;高浓度时,NIH 3T3成纤维细胞不能在培养液中生长。

四物汤浓度为4mg/ml 时,其诱导NIH3T3成纤维细胞上清对NFS-60细胞增殖作用最强。

由图5结果所示,四物汤、当归、白芍诱生NIH3T3细胞上清可显著促进NFS-60细胞的增殖,地黄则起抑制作用,川芎作用不显著。

我们另外的拆方结果表明:在两味药配合中,当归+白芍作用最强;在三味药配伍中当归+白芍+川芎作用最强。

图3 NFS-60细胞的G-CSF 剂量依赖生长曲线图4 四物汤诱生NIH3T3细胞上清对N FS -60细胞增殖的影响3 5 四物汤及其拆方诱生(相当于四物汤4mg/ml)NIH3T3细胞上清对NFS-60细胞增殖的影响 见图5。

图5 四物汤及其单味药诱生NI H3T3细胞上清对NFS-60细胞增殖的影响4 讨论成纤维细胞作为机体结缔组织的主要细胞成分,不仅具有活跃地合成细胞间质的功能,还可借助细胞间直接作用及产生造血调控因子广泛地影响血细胞的发生。

在造血组织内,它是造血诱导微环境(HIM )中重要的细胞成分,与其他基质细胞一起协调造血,构成造血细胞赖以生长、发育的内环境[6,7]。

而机体内非造血组织来源的成纤维细胞,它们或与217 2002年第9卷第4期中国中医药科技造血因子协同作用,或产生造血生长因子,亦参加造血发生的调节[8,9,10]。

目前的研究表明成纤维细胞所产生的调控造血的细胞因子有GM-CSF 、G-CSF 、M -CSF 、EPO 等,对造血干、祖细胞的分化发育起重要的调控作用,其中G-CSF 是一种重要的造血生长因子。

G-CSF 的作用不仅限于后阶段粒系定向祖细胞,近年资料表明亦能促进多能干细胞的增殖,刺激巨核细胞集落生长[11,12]。

本实验前期结果证明四物汤能够显著升高血虚小鼠外周血白细胞、血小板,促进造血祖细胞CFU -GM 、C FU-meg 、CFU -mi x 集落的增殖。

为进一步探讨四物汤的作用及配伍机制,利用MTT 法研究四物汤及其拆方诱导NIH3T 3成纤维细胞上清对G-CSF 依赖细胞株NFS-60增殖的影响。

结果表明:四物汤在终浓度为4mg/ml 时,诱生NIH3T3细胞上清对NFS-60增殖作用最强,这可能是四物汤升高血虚小鼠外周血白细胞,血小板,促进造血祖细胞CFU -GM 、CFU -meg 集落增殖的分子基础。

在此基础上,我们的拆方实验表明,白芍诱生NIH3T 3细胞上清的活性在四物汤方剂中起主要作用。

但是四物汤诱生NIH3T 3细胞上清具体有什么变化?而且四物汤对不同组织来源的成纤维细胞的诱生上清有什么不同?正是本课题进一步研究的内容。

(国家自然科学基金资助项目NO30070913) 参考文献1 Hsue-Yi n Hsu,Yau-Hui Ho,Chun-Ching Lin.Protection of mousebone marro w by Si-Wu-Tang agains t whole body irradiation.Journal of Ethopharmacology.1996;52:1132 马增春,高月,刘永学,等 四物汤对 射线照射致血虚证小鼠造血细胞作用的研究 中国实验方剂学杂志2001;7(3):413 袁久荣,朱建伟,李成韶,等 四物汤对两种血虚动物模型补血作用的比较 山东中医药大学学报1999;23(5):3834 刘秀珍 造血祖细胞培养技术实验手册 北京:北京出版社,1993;255 从玉文,陈家佩,邵源 辐射后造血细胞对造血因子增殖反应性变化的研究 军事医学科学院院刊1999;23(2):1196 Deryugina EI,M uller Sieburg CE.Cri tical Revie ws in Immuunology1993;13:1157 Weaver A,Ryder WD,Testa NG.Exp Hematol 1997;25:13338 Hangoc G,D oub R,Mazi BG,et al.Regulz tion of myelopoisis by murinefibroblastic and adiprogenic cell lines.Hematol1993;21:5029 Lee YY,Kurtz I,Yamato K,et al:Tumor necrosis factor stimulate Na/H antiporter i n human fi broblas ts:di ssociati on bet ween intracellular alka li nization and cytokin mR AN accumulati on.Bl ood1992;79:226210 Bachmann S,Lehir M,Eckardt K,Co-localization of erythroietin mRNA and Ec to-5-nucleotidase immunoreactivityn in peri tubular cells of rat renal cortex indicates that fibrobl as ts produce erythropoitin.J His tochem 1993;41:33511 Tanaka T,Suda T,Suda J,e t al.Stimulatory effects of granulocytecolony stimulating factor on colony formi ng units-spleen(CFU-S)dif ferentiati on and pre -CF U -S proli ferati on in mice.Blood1991;76:259712 Koi ke K,Nakahata T,Kubo T,et al.Interleukin-6enhances murinemegakaryocytopoiesis in serum-free culture.Bl ood1990;75:2282(收稿:2001-07-03)当归贝母苦参丸加味治疗产后尿潴留76例王 珏(浙江省舟山市人民医院 舟山316000)产后尿潴留是妇产科临床常见的疾病之一,多是由于产程过长,胎先露对膀胱颈及骨盆底长时间压迫,产生暂时性神经支配障碍。