最新[农林牧渔]抗菌肽基因工程表达技术研究进展-药学医学精品资料

从生物体内直 接提取纯化
化学方法 人工合成
采用基因工 程技术进行 抗菌肽人工 表达
但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生,含量较低, 从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和 成本的要求高,难以规模化生产,并且对于某些高 等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多 肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技 术的产生,人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗 菌肽的研究提供了很大方便。
包涵体可完全溶于8 mol/L的尿素,三聚体 形式的hPAB-β可用Ni-NTA亲和色谱分离, 再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等(2008) 成功构建了串联表达rAlloferon-1的原核表 达系统,并在E.coliBL21DE3中成功表达,其 表达产物具有与合成的Alloferon-1和 Alloferon-1-EK相似的体外抗肿瘤细胞活性。
刘静等(2008)用果蝇CecropinA原始氨基酸序列基础上,利 用毕赤酵母菌偏好的密码子,反推出其基因的序列,根据需 要对其中部分密码子进行调整,并在毕赤达酵母中成功表 达,但表达量不高,有待进一步的研究。仇妍虹等(2009)将 重组家蝇抗菌肽Des-HF基因克隆入酵母表达载体pPICZαA,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下, 相对分子质量约5000 u的重组抗菌肽Des-HF获得表达。

诸多研究结果表明,由于抗菌肽分子较小,化 学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致 的生物学活性,但化学合成的方法同样存在 成本较高的问题,限制了抗菌肽的推广应用。 现代基因工程技术的发展使借助基因工程 技术大规模制备抗菌肽成为可能。
2 抗菌肽的基因工程表达
进行抗菌肽研究的两种表达体系
原核表达体系 中大肠杆菌表 达体系最具代
近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是 一种甲醇营养型酵母,能利用甲醇作为唯一碳源; 它拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径,乙醇 氧化酶(AOX)是甲醇利用途径的第一个酶,甲醇是 这个酶的诱导剂,而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑 制剂。
Hong等(2007)运用毕赤酵母表达系统表达了人皮 肤抗菌肽LL-37,该基因装载于pGAPZ-E/LL-37载 体,转染毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达。结果目的蛋 白以分泌物的形式表达,产物纯化后经藤黄微球菌 测试具有抗菌活性;该研究结果表明,抗菌肽可以 通过酵母真核表达系统表达,而不必与其他蛋白融 合。
性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源 性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; 二、能诱导基因高效表达,为其他系统所不及; 三、能严格调控基因表达,既可控制基因表达的“开 关”,还可人为地调控基因表达量。
真核表达系统蛋白表达水平高,生产成本低,但它们 的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳 动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其 表达量低、操作繁琐。各种表达系统由于翻译后 的加工不完全相同,因而产生的重组蛋白的生物学 活性和免疫原性有时会有差别。如何克服在基因 工程表达中的缺点,是在抗菌肽生产表达中的重要 问题,同时也是研究表达体系要克服的难点问题。
通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基由于抗菌肽分子小而且表达产物可能对宿主有进而影响了基因的高水平表达如何有效降低抗菌肽表达产物对宿主菌的毒性提高表达效率简化提纯方法降低成本成为抗菌肽基因工程表达技术研究亟待解决的问题
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抗菌肽简介
抗菌肽是有机生物体用来抵御外来病原 体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分 子蛋白质,是很多种生物先天性非特异性防 御系统的重要组分。
1.下列词语中加点的字，读音全都正确的一组是（3分）
（）
A.蹩进（ｂｉé）
窗棂（ｌíｎɡ）
剥蚀（ｂāｏ）
汀州（ｔīｎɡ）
B.垝·垣（ɡｕǐ） 踯·躅（ｚｈí）
踟蹰·（ｃｈí） 落·枕（ｌｕō）
C.瞥·见（ｐｉē） 谛·听（ｄì）
D.青·荇（ｘìｎɡ） 跫·音（ｑｉóｎɡ）
缁·衣（ｚī） 岑·静（ｃéｎ） 喘·气（ｃｈｕǎｉ） 媛·女（ｙｕàｎ）
谢芳等(2009)为了验证重组抗菌肽 Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总 RNA,经RT-PCR扩增抗菌肽基因Ranalexin, 克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表 达载体,进行原核表达,表达产物经复性纯化 后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌 活性。
综合所述,原核表达是目前掌握最为成熟的表达系 统,是目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研 究的主要方式;其优点在于能够在较短时间内获得 基因表达产物,而且所需成本相对较低;但与此同 时,原核表达系统还存在许多缺点,如通常使用的表 达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些 基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用, 过量表达可能导致非生理反应。
表达试验结果证明,随时间的延长,表达产物 量增多,至120 h达到高峰,表达产物具有很强 的热稳定性。用抑菌圈法测定重组蛋白ProAS-hepc2的抗菌活性,结果发现能抑制革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。
综合所述与原核表达系统相比其优点是: 一、根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异
另外,目的蛋白通常以包涵体形式表达,导致 产物纯化困难。而且原核表达系统翻译后 加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性 较低。为克服上述不足,许多学者将原核基 因调控系统引入真核基因调控领域。
2.2 酵母菌表达体系
酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制 及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产 生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。
韩宗玺等(2008)采用GST基因融合表达系统 在E. coliBL21中重组表达鸡的Gal-9抗菌肽 基因,获得了理想的表达效果,诱导蛋白表达 量占细胞总蛋白的40%,并且大部分以包涵 体的形式存在。纯化后,检测其抗菌活性与 提取抗菌肽相似,说明有些抗菌肽在进行融 合表达时,不影响抗菌肽的抗菌活性。
表性
真核表达体系有小球藻 表达体系、杆状病毒介 导的昆虫表达系统、 酵母表达体系,其中酵 母表达体系用的最多, 是真核表达体系的代表
2.1 大肠杆菌表达体系
由于大肠杆菌系统对许多蛋白质有较强 的耐受能力,能较高水平地表达多种蛋白质 使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达 系统,所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术 的主要宿主细菌,在抗菌肽的表达研究中也 得到了充分的应用。
绪或感情的消解。根 据语境，应为“忘怀”。
5.下列各句中有语病的一句是（3分）
（ C）
A.一天清晨，我又到树林里散步，和我患同一种病症
的史同志手里拿着一支猎枪，正在瞄准树上的小鸟。
B.她为了保持自己的风姿，为了超越更久更久的时
代，为了漂向更远更远的国度，隐藏了那两条玉臂。
C.一方面极光与地球高空大气和地磁场的大规模相互
具有我们时代的聪明才智，于是面带微笑，进行了令 人 生畏的研究，但仍然游刃有余。
· · ·· C.“我——我——我丢了佛来思节夫人的项链了。”“什
么！哪儿会有这样的事！”他们惊惶地面面相觑。“我 ·· ··
去找一找，看看会不会找着。”路瓦栽重新穿好衣服。 D.胡同文化是一种封闭的文化。住在胡同里的居民大都
安之若素，不大愿意搬家。有在一个胡同里一住住几 · · ·· 十年的，甚至有住几辈子的。 解析 安之若素：指身处逆境，遇到困难或挫折时能泰然 处之，跟平常一样。与语境不符。改用“安土重迁”。 答案 D
4.依次填入下列各句横线处的词语，最恰当的一组是
（3分）
（）
①盛大公司的
是从网络游戏逐步扩展到互动娱
抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡 萄球菌有较好的抑菌活性。以小鼠为试验 模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的 体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组 Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死 浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003)和
CowanⅠ的攻击。
蔡晶晶等(2009)将黑鲷抗菌肽hepcidin与毕赤酵母 (Pichia pasto-ris) pPIC9K质粒连接,构建了分泌表 达载体pPIC9K/AS-hepc2。电击法转化重组表达 载体,经G418筛选和选择性培养基及PCR鉴定,得 到的克隆子都为甲醇利用正常性(Mut+)。以甲醇 诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku 左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin 的前体肽和成熟肽的大小相符。
乐传媒乃至上下游媒体、广告和制造产业，建立立体
化现实的盛大娱乐世界。
②即使郎平出任美国女排主教练，率队与中国女排决
战，甚至在2008年奥运会上，中美两国女排决一雌
雄，她也永远是中国人的骄傲。我们应该摒弃一切世
俗的
，并衷心地祝福她。
③那青青的荷叶，或一两株高擎荷盖，或三五丛傍水
而居，为我的休闲生活平添了许多乐趣，那碧绿欲滴
3 展望
抗菌肽与传统抗生素相比其抗菌性具有很大优越 性,特别是抗菌肽不产生耐药性;但抗菌肽的来源 一直是进行药理研究和推广应用难以突破的瓶颈。 由于抗菌肽的分子小、含量低,直接从生物组织中 提取、分离提纯存在一定的困难;而化学合成成本 高不易推广应用;基因工程就成为获得抗菌肽的主 要手段。
通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽 基因,由于抗菌肽分子小,而且表达产物可能 对宿主有害,进而影响了基因的高水平表达, 如何有效降低抗菌肽表达产物对宿主菌的 毒性、提高表达效率、简化提纯方法、降 低成本成为抗菌肽基因工程表达技术研究 亟待解决的问题。
·
·
·
·
解析 A项“剥”读ｂō。B项“落”读ｌàｏ。C项“喘”
读ｃｈｕǎｎ。
答案 C
2.下列句子中没有错别字的一句是（3分）
（）
A.“睡一会罢，——便好了。”小栓依他母亲的话，咳
着睡了。华大妈候他平静下来，才轻轻的给他盖
上了满副补丁的夹被。
B.四百多年里，它一面剥蚀了古殿檐头浮夸的琉璃，
淡退了门壁上炫耀的朱红，坍圮了一段段高墙又散
作用有关，另一方面又与太阳喷发出来的高速电粒
子流——通常称为太阳风——有关。
D.时间膨胀不仅为探索人类能力所不能及的宇宙提供
了方法，它也是一种时间旅行。
解析 关联词词语位置不当，“一方面”应该放在主语
的万顷荷塘，更透出一阵阵幽香，一缕缕清韵，让人
难以
。
A.图景
偏见 释怀
B.远景
成见 忘怀
C.远景
偏见 忘怀
D.图景
成见
释怀
解析 图景：描述或想像中的景象；远景：将来的景
象。两者的区别在于：“图景”偏重“描述想像”，
而
“远景”偏重“规划设计”。偏见：偏向于一方面的
见
解，侧重于一方；成见：对人或物所抱的固定不变的 看答法案，C侧重固执。忘怀：忘记；释怀：人内心某种情
Peng等(2004)将人β-防御素2(hBD2)的基因插入 到pET-32a(+)中构建融合表达载体,以E. coliBL21 为工程菌进行表达,纯化后的蛋白质具有抗菌活性, 该研究结果表明,应用基因工程技术可以大规模制 备抗菌肽。Rao等(2005)采用串联表达的方式在大 肠杆菌中表达hPAB-β取得成功,在1~8个不同重复 序列的串联表达体系中,3个重复序列时蛋白质产 量最高,达到菌体总蛋白的27.8%,相当于 (3.15±0.45) g/L湿菌。
解析 A项满副—满幅。C项胜地—圣地，D项侵渍— 浸渍。
答案 B
3.下列各句中加点的成语使用不恰当的一句是（3分） （）
A.像一切动了爱情的女子一样，在她心目中，爱情便 是整个世界，可是查理不在眼前。她对老父亲的照
顾服侍，可以说是鞠躬尽瘁。 · ·· ·
B.巴尔扎克由于他自由的天赋和强壮的本性，由于他
落了玉砌雕栏，祭坛四周的老柏树愈见苍幽。
C.真不知道一个堂堂佛教胜地，怎么会让一个道士来
看管。中国的文官都到哪里去了，他们滔滔的奏折
怎么从不提一句敦煌的事由？
D.然而既然有了血痕了，当然不觉要扩大。至少，也 当侵渍了亲族，师友，爱人的心，纵使时光流驶， 洗成绯红，也会在微漠的悲哀中永存微笑的和蔼的 旧影。
自20世纪70年代瑞 典科学家Boman等 从蚕蛹中分离得到 第一个抗菌肽—天 蚕素(cecropin)以来。 人们陆续又在昆虫、 两栖类、水生动物、 及包括人在内的哺 乳动物甚至植物及 细菌等广泛的生物 谱中发现了1700余 种抗菌肽。
抗菌肽的来源
一般而言,抗菌 肽可通过以下 3种途径获得