BcWRKYⅡ基因对玉米的转化及提高玉米抗逆性研究

BcWRKYⅡ基因对玉米的转化及提高玉米抗逆性研究玉米(Zea mays L.)在我国的国民经济和人民生活中占有非常重要的地位,2012年全国玉米产量为20812万吨,产量超过稻谷产量383万吨,成为我国第一大粮食作物。

干旱、盐碱和低温等逆境环境胁迫因子是玉米生长的主要限制因素,严重影响玉米产量。

通过基因工程技术将外源抗逆相关基因导入玉米来提高玉米的抗逆性,进而选育出玉米抗逆品种已经成为当前玉米基因工程育种的一个热点,应用前景十分广阔。

本研究以黑龙江省重点应用和改良的玉米自交系为材料,优化了玉米未成熟胚和茎尖再生体系,分别以农杆菌介导的胚性愈伤组织转化法、农杆菌介导的离体茎尖转化法、农杆菌介导的茎尖原位转化法和花粉管通道法将来源于耐旱植物厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia)的转录因子BcWRKYⅡ基因转化自交系,并对转基因植株进行了分子检测和生理检测,获得遗传稳定的转基因品系。

主要研究结果如下：1、优化了玉米幼胚和茎尖再生体系通过对基因型、激素配比等条件的优化建立了玉米幼胚再生体系和茎尖再生体系,为遗传转化的研究奠定了基础。

玉米幼胚再生体系：基因型郑58,诱导培养基：N6盐+120mg/L 肌醇+500mg/L L-pro+500mg/L CH+2mg/L2,4-D+10mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+6.5g/L 琼脂,pH5.8；继代培养基N6+2mg/L2,4-D+15g/L甘露醇。

分化培养基：N6盐+120mg/L肌醇+690mg/L L-pro+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+2.0mg/L6-BA, pH5.8o茎尖再生体系为：基因型K10,诱导培养基
MS+1.0mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA;丛生芽分化培养基：MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L IB A2、明确了愈伤组织和茎尖分生组织对筛选物的敏感性研究了愈伤组织和茎尖分生组织对筛选物的敏感性。

愈伤组织对筛选抗生素的敏感性顺序依次是：遗
传霉素G418>巴龙霉素Par>卡那霉素(Kan)>新霉素(Neo)。

在抗性愈伤筛选中,遗传霉素的适宜浓度为15～30mg/L,巴龙霉素Par的浓度为30～50mg/L, PPT筛选的适宜浓度为3～5mg/L。

茎尖对各种抗生素的敏感性顺序与愈伤组织相同,在筛选过程中,遗传霉素的适宜浓度为15～30mg/L,巴
龙霉素Par的浓度为30～50mg/L, PPT筛选的适宜浓度为1～3mg/L。

3、优化了不同遗传转化方法的试验条件。

农杆菌介导的愈伤组织转遗传化条件：基因型郑58,农杆菌菌液浓度为OD600=0.8,乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,真空处理时间为5min,平均抗性愈伤率为抗性愈伤率为12.55%：农杆菌介导的离体茎尖遗传转化的条件：基因型K10,农杆菌菌液浓度为OD600=0.8、乙酰丁香酮浓度为150μmol/L,真空处理25min,平均抗性苗率为34.00%；农杆菌介导的茎尖原位转化的条件：基因型郑58、真空处理时间20min、OD600=0.9,AS浓度150μmol/L、Silwet-77浓度0.05%,平均抗性苗率为9.84%。

花粉管通道法的优化条件：基因型龙抗11、授粉后16h导入、DNA浓度为200ng/ul,平均抗性苗率为4.81%4、获得了整合BCWRKYⅡ基因的纯合植株通过抗性株的PCR检测,Southern杂交及RT-PCR检测,证明外源BcWRKYⅡ基因已经整合到玉米基因组中,并且获得了转基因纯合株系。

5、外源BcWRKYⅡ基因的转化提高了玉米抗旱和耐盐性转基因植株的抗旱性分析表明,4个转基因株系单株产量性状抗旱性提高了11%～41%。

行粒数的增加是影响转基因玉米抗旱性提高最重要的原因。

耐盐性分析表明BcWRKYⅡ基因的转化主要通过提高了转基因植株的叶绿素含量,降低了叶片伤害度和丙二醛含量,最终促进了转基因植株NaCl胁迫下生物量的提高。