自-庆大霉素药物制备工艺设计

庆大霉素药物的制备工艺设计
目录
第一章项目总论 (1)
1.1庆大霉素的结构性质 (1)
1.2庆大霉素作用机理 (1)
1.3庆大霉素的优缺点 (1)
1.4庆大霉素的应用与发展前景 (2)
第二章技术方案 (3)
2.1生产工艺流程设计 (3)
2.2庆大霉素的种子培养和发酵培养工艺流程 (4)
2.3种子培养和发酵培养工艺说明 (4)
2.3.1 菌种 (4)
2.3.2 孢子制备 (4)
2.3.3 种子培养 (5)
2.3.4 发酵培养 (5)
2.4庆大霉素发酵液的提取和精制 (6)
2.4.1 发酵液的预处理和过滤 (7)
2.4.2 吸附与解吸 (7)
2.4.3 庆大霉素的精制 (8)
2.4.4 庆大霉素的洗脱和脱色 (8)
2.4.5 庆大霉素的干燥 (9)
第三章防污措施 (10)
3.1废水渣的处理 (10)
3.2废气的处理 (10)
3.3废渣的处理 (10)
结语 (11)
参考文献 (12)
第一章项目总论
1.1 庆大霉素的结构性质
庆大霉素(Gentamicin，GM)是由放线菌属小单孢菌(Micromonospora purprua)发酵产生的氨基糖苷类广谱碱性抗生素，临床上常用其硫酸盐。

硫酸庆大霉素为白色或微黄白色的粉末，无臭，对光、空气、广泛pH及热稳定（在pH 4、60℃保存35~180天，对溶液的效价影响不大，在pH 4以下，其效价降低8%~30%），有吸湿性。

易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚及苯。

庆大霉素是目前临床上用于各种革兰氏阴性菌感染的主要抗菌药物之一，是由2-脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成的多组分混合物。

它也是我国独立自主研制成功的广谱抗生素，由于是产生于无产阶级文化大革命中的科技成果，故取名“庆大霉素”，意指庆祝“九大”以及工人阶级的伟大胜利。

其化学结构如图1-1所示：
图1-1 庆大霉素的化学结构
1.2 庆大霉素作用机理
为抑制细菌蛋白质的合成，庆大霉素能影响蛋白质合成的许多环节：(1) 起始阶段，抑制70S 启动复合物的形成；(2) 选择性地与30S 亚基上靶蛋白结合，使mRNA 上的密码错译导致异常的、无功能的蛋白质合成；(3) 阻碍终止因子(R)与核蛋白体 A 位结合，使已合成的肽链不能释放并阻止70S 核蛋白体的解离，最终造成菌体内核蛋白体的耗竭。

此外，氨基糖苷类通过离子吸附作用附着于细菌体表面造成胞膜缺损致使胞膜通透性增加，细胞内钾离子、腺嘌呤核苷酸、酶等重要物质外漏，从而导致细菌死亡，对静止期细菌作用最强。

1.3 庆大霉素的优缺点
与其他抗生素相比，庆大霉素有着明显的优势：(1) 抗菌谱广，对革兰氏阳性菌有很好的疗效，对革兰氏阴性菌如绿脓杆菌也有较强的作用；(2) 价格低廉；(3) 化学性质稳定，可制成针剂；(4) 没有过敏反应。

当然，庆大霉素也有其缺点，主要是毒副作用比较大，
特别是对耳、肾有较大的副作用，这一方面也越来越引起人们的关注，因此寻找能产低毒高抗庆大霉素的优良菌株以及庆大霉素的替代品成为研究的热点。

但尽管如此，目前庆大霉素仍然被广泛应用于临床和畜牧业，有着很大需求。

1.4 庆大霉素的应用与发展前景
由于其对金葡菌及大肠杆菌、产气杆菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌等G－菌作用较强，所以适用于敏感细菌所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染（包括脑膜炎）、尿路生殖系统感染、呼吸道感染、胃肠道感染（包括腹膜炎）、胆道感染、皮肤、骨骼、中耳炎、鼻窦炎、软组织感染（包括烧伤）、李斯特菌病等，在临床中广泛使用。

我国庆大霉素的生产历史已有20多年，生产工艺改进不大，整体状况不容乐观，产量低，成本高，致使厂家连年亏损，经济效益极差，纷纷停产或是转产。

而国外GM的生产也不尽如人意，由于高投入，低产出，使得西方各国的庆大霉素的生产受到限制，导致一些国家纷纷瞄准国际市场，采取大量购进无菌庆大霉素粉剂的方法，以满足临床需求。

因此目前国际市场庆大霉素粉剂供不应求，由此可见，如何尽快选育出优良高产菌种是国内外一致关注的课题。

第二章技术方案
2.1 生产工艺流程设计
查庆大霉素的技术规格及质量标准见表2-1。

≥590/mg
≤ ppm
≤5万单位
≤5万单位
D-葡萄糖→2-脱氧青蟹肌醇→2-脱氧青蟹醇胺
↓↓
D-葡萄糖胺→ 巴龙胺← 2-脱氧链霉胺
↓
庆大霉素A
↓C-甲基化和差向异构化
庆大X2
脱氧↓氨基化↓L-甲基化
抗生素JI-20A 抗生素G418
脱氧↓ ↓脱氧，氨基化
庆大霉素C1a抗生素JI-20B
↓N-甲基化↓脱氧差向异构化
庆大霉素C2b 庆大霉素C2
↓N-甲基化
庆大霉素C1
图2-1 生物合成庆大霉素的可能途径
因此，本设计所采用的工艺路线为先从沙土管中取出孢子接种到原斜面上（或从液氮
保存的孢子接种到原斜面上），7天后接合格种子到代1斜面上，6天后接白色丰满的菌落到摇瓶中，29.5hr 后接6-8瓶摇瓶种子到小罐中，并经中罐种子扩大培养后接到发酵罐中，接种方法为单种，放罐后至后处理车间。

2.2 庆大霉素的种子培养和发酵培养工艺流程
图 2-2 发酵工艺流程图
2.3 种子培养和发酵培养工艺说明
2.3.1 菌种
小单孢菌是一属能产生多种具有临床价值抗生素的微生物，在先后报道的60种小单
抱菌中，就有40多种产生抗生素，其中包括大环内酯类、氨基糖苷类、安莎类和蒽环类等等。

小单孢菌不仅可以产生链霉菌所产生的抗生素，如放线菌素、新霉素、红霉素等，而且还产生庆大霉素(Gentamicin)、西索米星( Sisomicin )、阿司米星(Astromivin)、扁枝衣霉素(Eveyninomicin)，特别是以近年来找到的新抗生素的数目而言，小单孢菌已超过链霉菌而跃居首位。

小单孢菌有巨大的潜力，日益受到人们的青睐和重视。

然而，由于小单孢菌分布奇特，生长缓慢。

小单孢菌在发酵罐中的浓度一般大罐发酵仍维持在1100 U/mL 左右。

庆大霉素生产菌一般在真空冷冻干燥状态下保藏其分生孢子，也可用甘油和乳糖溶液
做悬浮剂，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子悬浮液或营养菌丝体。

一般分生孢子传代比菌丝体更容易变异。

保藏冷冻营养菌丝体可避免分生孢子传代可能造成的变异。

2.3.2 孢子制备
孢子培养以生产丰富的孢子为目的，种子培养以繁殖大量健壮的菌丝体为目的。

小单孢菌的生产菌种保藏在沙土管中 ，由砂土孢子接入母瓶斜面培养基上，在28℃
培养6~7天。

孢子制备不但需要一定的温度还要有适当的湿度，小单包子菌活化的最适湿度一般50%左右。

培养基一般为：孢子萌发培养基(% ) : 1 号培养基: K 2HP4 0. 01 , NaCl 0. 05, Mg SO4 0. 05, 葡萄糖0. 1, 小麦汁2. 0; 2 号培养基: K2HP4 0. 01, NaCl 0. 05, MgSO4 0. 紫色小单孢菌 母瓶斜面孢子 生产斜面孢子
母瓶孢子培养 28℃，6-7d
生产斜面孢子培养 28℃，6d （砂土管） 子瓶培养液 子瓶培养
28℃，45h 一级种子罐培养
28℃，62h ，1.4V/（V·min ） 一级种子液
28℃，4-7d ，1.6V/（V·min ） 二级种子罐培养 二级种子液 发酵罐培养
30℃，pH6.8-7.0，8d ，
0.58V/（V·min ） 发酵液
05, 小麦汁2. 0; 3 号培养基: NaCl 0. 05, MgSO4 0. 05, 小麦汁2. 0。

制备成孢子后真空干燥
保存备用。

2.3.3 种子培养
生产时按一定的接种量移入一级种子罐，然后移入二级种子罐，二级种子罐的培养基
要尽量接近发酵液培养基。

如果种子量不能满足发酵罐接种量的要求须进一步进行三级以
及四级种子培养。

在种子培养时还需要适当添加一些辅料。

各级种子罐的相关条件如下：
一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。

培养基含有葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，
玉米油，消沫剂等。

pH自然，空气流量1：3（体积比）；300-350r/min；温度（27±1）℃,
40-50h,菌丝浓度达40%以上。

二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。

培养基含有葡萄糖、玉米浆等。

pH自然，空气流量：
1:（1-1.5）；250-280r/min；（25±1）℃。

14h，菌丝浓度40%以上，残糖1.0%左右，无杂菌，为合格种子。

表2-2 一级种子罐培养参数
培养时间罐温罐压空气压力空气流量搅拌时间
48小时左右37度0.06MPa 0.1MPa 30m*3/h --
表2-3 二级种子罐培养参数
培养时间罐温罐压空气压力空气流量搅拌时间
24小时培养37度0.03MPa 0.7MPa 170m*3/h -- 菌种一二级种子罐培养的菌体必须经过镜检以查看其是否满足发酵活化菌种生长要
求。

小单孢菌的一二级镜检结果满足下表2-4、2-5参数才能进行发酵接种。

表2-4 一级种子罐镜检参数
生长时间菌丝形态菌丝数量杂菌情况
22h 小网、分支短量少正常
30h 网团、实团量一般正常
38h 网团、较伸展量较多正常
46h 实团、边散量多正常
51h 实团、伸展量多正常
表2-5 二级种子罐镜检参数
生长时间菌丝形态菌丝数量杂菌情况
4h 散网、连片量多正常
8h 大网片、伸展量多正常
12h 大网片、伸展量多正常
16h 大网片、伸展量多正常
2.3.4 发酵培养
培养基：
(1) 碳源：碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。

根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量控制糖的流加。

葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。

残糖在0.6％左右，pH开始
升高时流加糖。

(2) 氮源：玉米浆是最好的选择，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。

补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素补氮。

(3) 无机盐：硫、磷、镁、钾等。

铁有毒，控制在30ug/ml以下。

(4) 前体：在合成阶段，选择苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等，抑制细胞生长和青霉素合成，以低浓度流加，保持供应速率略大于生物合成需要。

发酵条件控制：
(1) 温度：庆大霉菌生长适宜温度30℃，合成适宜温度25℃，20℃时，庆大霉素破坏少，但周期很长，故而采取变温控制，不同阶段不同温度。

在生长阶段以较高温度，缩短生长时间；生产阶段则适当降低温度，以利于庆大霉素合成；前期控制在25-26℃左右，后期降温控制24℃。

(2) PH：合成适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，在碱性条件下不稳定，易水解。

pH 下降通过流加CaCO3、通氨水调节或提高通气量；pH上升通过流加糖或天然油脂。

(3) 浓度溶氧：当溶氧浓度＜30％饱和氧浓度时，产率急剧下降；＜10％饱和氧浓度时，将造成不可逆的损害。

临界溶氧浓度为30％，相应通气比为1：0.8VVM，适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧。

根据各阶段的生长和耗氧量不同，调整搅拌转速:。

临界菌体浓度：溶解氧速率和氧消耗速率达到平衡时的菌体浓度。

>此浓度，则供氧不足，溶解氧下降，发酵产率下降。

发酵稳定期，湿菌浓15%-20%,菌干重3%-5%左右
(4) 消泡：发酵过程会不断产生泡沫。

发酵前期的泡沫主要是花生饼粉和麸质粉引起的，可间歇搅拌，不能多加油；中期泡沫可以加油控制，必要时可略降低空气流量，但搅拌应开足，否则会影响菌种的呼吸；发酵后期尽量少加消泡剂。

2.4 庆大霉素发酵液的提取和精制
庆大霉素发酵液的提取和精制流程如图所示：
图2-3 发酵液的提取和精制示意图
2.4.1 发酵液的预处理和过滤
发酵结束时，有一部分庆大霉素是与菌体结合的。

工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂
处理，释放与菌体结合的庆大霉素，一草酸效果最好。

用草酸将发酵液酸化至pH3左右，加入泡敌以便提高过滤速度，还可以采取加热发酵液至70℃左右维持2分钟，使蛋白凝固以提高过滤速度，然后迅速过滤或离心分离。

所得酸性滤液也可再经碱性处理，进一步除去蛋白质，或直接用氯化钠溶液调pH6.7~7.2，既得原液。

原滤液的质量一般标准是：外观澄清，pH6.7~7.2，温度在10℃以下高价离子很少，其浓度达到5000U/ml 。

选择原液pH7.0左右，有利于庆大霉素的稳定，可减少庆大霉素的破坏，并由其解离性，有利于Na +型羧基树脂解离。

原液中杂离子(Ca 2+,Mg 2+)对离子交换的吸附量影响很大，因此要在预处理时给予去除。

草酸去除钙离子：一些络合剂如三聚磷酸钠能与镁离子形成络合物，去除镁离子。

庆大霉素价位较高，吸附时一般优先吸附。

具体操作方法如下：
(1) 备好酸化用草酸、中和用10mol/LNaOH ，压备用树脂入计量槽。

(2) 接发酵液入酸化罐，缓缓加入草酸，调pH1.4-3.0，加入泡敌消沫。

(3) 加适量饮用水稀释（20%左右），用10mol/LNaOH 中和pH6.4-6.8。

2.4.2 吸附与解吸
庆大霉素在中性溶液中呈3价的阳离子，可以用阳离子交换树脂吸附。

由于羧基树脂
吸附链霉素后容易用酸洗脱，目前生产上都用Na+型羧酸树脂来提取庆大霉素。

吸附的方式有正吸附和反吸附两种。

前者是庆大霉素原滤液由上而下通过离子交换柱，后者由下而发酵液 酸化处理
1~2倍量水，草酸
酸化液 酸化滤液
过滤或离心 中和 NaOH pH3，70-75℃ 10℃以下，pH6.7~7.2 中和滤液 离子交换 Na +型弱酸树脂 饱和树脂 洗脱
7%H 2SO 4
洗脱液
精制，中和 H +型强酸树脂，OH -型弱碱树脂 精制液 脱色，过滤
2%~3%活性炭
pH4.3~5.0 脱色液 薄膜浓缩 35℃，20mmHg 浓缩液 酸性脱色，过滤 H 2SO 4，2%~3%活性炭 pH2.5 酸性脱色液 中性脱色，过滤
Ba （OH ）2，1.5%~2%活性炭 pH5.5~6.0
成品浓缩液 无菌过滤，喷雾干燥 成品
上进行吸附。

为了防止庆大霉素损失，提高收率，一般都采用3柱或4柱串联吸附。

依原滤液流向依次称为主柱、副柱、次柱等，应使最后一柱流出液中庆大霉素单位在100U/ml 以下。

当主柱流出液中的庆大霉素浓度达到进口浓度的95%左右时，就认为达到饱和，可以解吸。

这时将副柱升为主柱，次柱升为副柱，以此类推，在最后再加一柱继续吸附。

待解吸的柱先用软水洗净，然后用7%左右的硫酸解吸。

解吸的流速要慢，一般为吸附速度的1/10.当解吸液中出现了庆大霉素单位时，就在后面接上脱色树脂柱和中和树脂柱。

解吸一开始出现的低单位液可并入原滤液中重新吸附。

当解吸流出液达到一定浓度时，可作为高单位液开始收集；解吸出口液的pH值明显下降，浓度降至一定程度时，可作为酸性低单位液收集，调pH到7，供重新吸附。

有时为除去一些色素，吸附饱和的树脂也可以用氨水进行洗涤。

2.4.3 庆大霉素的精制
庆大霉素洗脱液中含有许多有机无机杂质，这些杂质对产品质量影响很大，特别是与庆大霉素理化性质近似的一些有机离子杂质毒性较大，采用羧酸型阳离子交换树脂难以去除，致使洗脱液中庆大霉素含量只能达到80~90%。

无机阳离子杂质和小分子的有机阳离子杂质也影响产品质量。

高交联度的H+型磺酸树脂的结构紧密，可以起到离子筛的作用，将庆大霉素与杂质分开。

溶液中的小离子与庆大霉素大离子在树脂中扩散速度不同，小离子扩散速度快，很快被交换在树脂上而除去；庆大霉素离子体积大，扩散速度慢，在H+型磺酸树脂上的交换量很小(10000U/g干树脂以下)，于是经树脂流出。

用高交联度树脂精制后，由于杂质离子被交换到树脂上而被置换出部分H+，流出液变酸，需经OH-型弱碱树脂中和，得到精制液。

2.4.4 庆大霉素的洗脱和脱色
将所得的精制液用硫酸或氢氧化钡调pH至4.3~5.0，并根据精制液的透光度加入适量的活性炭进行常温脱色，过滤后得透光度在95%以上的滤出液。

精制液需要蒸发浓缩来达到所需浓度要求。

由于庆大霉素是热敏物质，易受热破坏，故采取低温快速浓缩。

控制pH4.0~4.5、温度在35℃以下进行真空薄膜蒸发浓缩，浓缩液应达到35×104U/ml左右。

所得浓缩液还含有色素和热原质，需经酸性脱色和中性脱色才能达到成品质量要求。

浓缩液经硫酸调Ph2.5(也可不调)，加入适量活性炭脱色，得酸性脱色液。

再用氢氧化钡热饱和溶液调pH5.5~6.0，加入适量活性炭脱色，得成品浓缩液。

具体操作方法：
(1) 配制4.5-5.3%的浓氨。

(2) 用纯化水疏松并冲洗树脂中氮根。

(3) 用4.5%-5.3%浓氨水解吸至洗脱液旋光效价控制在1000 u/mL。

(4) 第2罐透光度低于70%时，用2mol/L HCl和2mol/L NaOH对711脱色树脂进行再生，使其可以循环使用。

注意洗脱收率在98﹪以上。

先抽入总体积2/3的纯化水，在夹层冷却下再缓慢抽入1/3的浓硫酸，搅拌均匀，冷却应在0.5小时以上。

上批装塔的浓缩液与本批浓缩液混合后压入成盐炭脱罐。

在不断搅拌及夹层通冷却水冷却下缓慢加入6mol/L的硫酸液，调pH至5.0~6.0，当pH在5.0左右时取样检测。

2.4.5 庆大霉素的干燥
在成品浓缩液中加入稳定剂(如亚硫酸钠)，经无菌过滤，既得水针剂。

将成品浓缩液经无菌过滤、喷雾干燥后，即制得粉针剂。

第三章防污措施
庆大霉素发酵提取产品后的提取液中还含有剩余的非提取成分，如原料中的有机物，有害物质以及没有完全回收的化学试剂等。

这些直接排放到环境中都会对环境照成很大的污染，因此的进一步对其处理。

利用各种生物工程技术回收降解排放物中的有机物，有害物等。

循环利用回收有用物质，已达到环保经济的效果。

人对水资源的开发、利用的循环，是人类活动参与的水循环。

3.1 废水渣的处理
由于本生产中所用水大都为洗刷设备用水。

水中含有有机化学试剂成分，故需要回收废水中的有机溶剂，使水重新利用。

采取水循环利用的措施，例如废水的有机溶剂回收，采用蒸发仪回收有机溶剂。

同时可以采用微生物分解胆汁中的有害物质，水经过沉淀，过滤和生物处理，从而达到排放标准。

但大多数可以作为循环用水。

3.2 废气的处理
在发酵过程中会产生大量的二氧化碳，若将二氧化碳直接排到大气中会污染环境，尤其是在温室效应日益明显的今天，回收二氧化碳显得尤为重要。

二氧化碳的回收可采用液态法回收工艺，预提要经过洗涤、净化、压缩、干燥、冷却、液化等过程。

回收的二氧化碳可进行综合利用，主要有以下几个方面：（1）制备稀释用水。

利用二氧化碳置换作用，制备脱氧水，作为高浓度酿造稀释用水。

（2）二氧化碳洗涤。

3.3 废渣的处理
发酵厂废渣污染问题与废水，废气相比，一般要小的多，废渣的种类和数量也比较少。

常见的废渣包括蒸馏残渣，失活的催化剂，废活性炭，胶体废渣，反应残渣等。

不合格的中间产品，以及用沉淀，混凝，生物处理等方法产生的污泥残渣等。

一般处理方法：①废发酵液经回收后送到干燥车间，经加工后制成粗饲料卖给饲料厂家。

②设立专门的灰渣池对灰渣进行沥水与堆放，经沉渣池处理后的冲灰渣水通过水泵进行循环利用。

经沉渣池处理的锅炉燃烧煤渣，卖给外单位作制砖材料。

③环保污泥经压榨后与煤拌烧。

结语
通过对庆大霉素制备工艺的设计，在巩固课本知识的同时，拓宽了我们对生物制药，尤其是对庆大霉素生产工艺的了解和掌握，使使我们懂得了生物药物制备的一般程序、工艺以及方法，特别是熟知了工艺流程。

完成这个课设，深感知识的匮乏。

其中每一步都涉及很多知识，例如生产工艺的设计、工艺流程条件的控制，这些都不是在课堂上所能全面掌握的。

很多不能明白的知识要通过查找大批的资料，还要很好的与老师沟通，在此方面锻炼了我快速查找资料的能力和与老师沟通协调的能力。

最终在指导老师张雁南、孙洪雁等老师的指导下顺利的完成了这个课设。

在这里要向他们表示特别地感谢!
本课设详细的说明了庆大霉素制备的工艺流程图，并对其进行了详细的解说。

从菌种的选择、发酵条件的控制、发酵液的提取方法、成品的最终制成等每一步都做了解释说明。

能够达到思路清晰，简单明了，能够符合老师的课设要求。

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