补阳还五汤及其精简方抗脑缺血损伤功效比较

补阳还五汤及其精简方抗脑缺血损伤功效比较
目的评价补阳还五汤及其精简方对脑缺血损伤的保护作用。

方法体内实验：SD大鼠按体质量随机分为假手术组、局灶性脑缺血（MCAO）模型组、补阳还五汤组和补阳还五汤精简方组，每组10只，观察各组大鼠体质量、脑梗死面积和脑含水量等指标的变化。

体外实验：采用过氧化氢（H2O2）对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）致损，建立体外氧化应激细胞模型，将PC12细胞分为正常组、空白对照组、补阳还五汤组和补阳还五汤精简方不同浓度组（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL）及模型组，MTT法考察补阳还五汤及其精简方对模型细胞的保护作用。

结果体内实验表明，补阳还五汤及其精简方给药7 d后，均能恢复MCAO模型大鼠的体质量、降低脑梗死面积、减轻脑组织水肿，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），两方组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；体外实验表明，补阳还五汤及其精简方与细胞作用2 h即能发挥保护作用，对H2O2所致的氧化应激损伤有明显的保护作用，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），细胞存活率升高，同一浓度两方组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

结论体内外实验均表明，补阳还五汤精简方在抗脑缺血损伤方面功效显著，且药效不亚于补阳还五汤，在保证药效的前提下大大节约了中药资源。

标签：补阳还五汤；补阳还五汤精简方；脑缺血；局灶性脑缺血大鼠模型；氧化应激细胞模型
缺血性脑卒中由于病因病情复杂，且神经元受损后恢复差，迄今为止尚未研制出一种理想的西药，因此，国内越来越注重传统药物的研制与开发。

补阳还五汤出自《医林改错·瘫痿论》，系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辨证属气虚血瘀证的经典名方。

现代研究表明，该方对脑缺血病疗效确切，不良反应小，适合长期服用[1-3]。

但补阳还五汤作为传统中药方剂，药效物质基础难以阐明，不能完全满足国际市场的标准规范。

因此，针对病因病机筛选出物质基础明确、给药剂量小、疗效好的中成药是当今中医药治疗缺血性脑卒中的发展方向。

本课题组遵循补阳还五汤方义，将其精简为黄芪、川芎和地龙，并对补阳还五汤及其精简方在抗脑缺血方面进行功效比较研究，为开发“高效”、“低毒”、对缺血性脑卒中疗效显著的现代中药提供实验数据。

1 实验材料
1.1 动物与细胞
SPF级SD大鼠，40只，雄性，250～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞），高分化，购自长沙赢润生物技术有限公司。

1.2 药物
补阳还五汤（黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，地龙3 g）及其精简方（黄芪30 g，川芎9 g，地龙6 g）干浸膏均由湖南中医研究院中药所张水寒教授提供。

补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于4.5 g原药材/g。

补阳还五汤精简方按新工艺制备，其中川芎以挥发油量为考察指标，对川芎粗粉进行SFE-CO2萃取，不加夹带剂，提取1.5 h；地龙以醇浸膏得率及氮含量为指标，温浸2次，第1次加5倍量50%乙醇温浸48 h，第2次加4倍量50%乙醇温浸48 h；再合并药渣，与黄芪药粉一同水煎，所有药液浓缩干燥后即得干浸膏，相当于4.7 g原药材/g。

1.3 主要试剂与仪器
水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司）用PBS配制成10%的溶液待用；四氮唑红（TTC，英国BIOFER公司）用PBS 37 ℃恒温水浴配制成1.5%的溶液，避光待用；DEME高糖培养基（HyClone）；D-Hanks （Solarbio）；青霉素-链霉素溶液（Beyotime）；胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（北京索莱宝）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Sigma，美国）；二甲基亚砜（DMSO，BIOSHARP）；其他试剂均为分析纯。

Image-Pro Express图像分析系统（日本Olympus公司），TP-1000电子天平（中国湘仪天平仪器厂），恒温水浴箱（重庆仪器厂），CO2培养箱（Galaxy 170R，NEW BRUNSWICK an eppendorf campany），多功能酶标仪（Varioskan Flash，Thermo ScienTific），双人单面超净工作台（DL-CJ-2NDI，北京东联哈尔仪器制造有限公司）。

2 实验方法
2.1 体内实验
参照文献[4]方法。

采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠（MCAO）模型。

按体质量将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、补阳还五汤精简方组，每组10只。

补阳还五汤及其精简方组于术后第1日起给药，分别以3.15 g/kg和2.41 g/kg药液灌胃，给药容积10 mL/kg；模型组和假手术组给予等容积无菌蒸馏水。

每日1次，自由饮食、活动。

给药7 d后处死取材。

每组大鼠均于术后及处死前1 h称取体质量，记录其体质量变化情况；按文献[5-6]方法检测脑梗死面积和脑干湿重。

2.2 体外实验
采用过氧化氢（H2O2）处理PC12细胞建立氧化应激损伤模型：将PC12细胞接种于96孔板种，待细胞生长至对数生长期，分别用含H2O2终浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的无血清培养液继续培养，于1、2、4、8、12、24、48 h后采用MTT法检测细胞存活率，每孔加入10 μL MTT溶液，4 h 后，加入100 μL DM SO，用酶联免疫检测仪测量490 nm处各孔的吸光值（OD 值）并计算细胞存活率[（处理组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%]，以确定H2O2致损模型所需的浓度和时间。

将PC12细胞接种于96孔板中，待细胞生长至对数生长期，将细胞分成正常组、空白对照组（不
加细胞，仅加入细胞培养基）、补阳还五汤组及其精简方不同浓度组（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL）、模型组（仅加H2O2处理）。

先将细胞与药物共同作用2 h，再加入H2O2继续培育2 h，MTT法测定各组细胞存活率，考察不同药物对氧化应激损伤模型细胞的保护作用。

3 统计学方法
采用SPSS16.0及matlab2010统计软件进行分析。

实验数据用—x±s表示。

组间比较采用方差分析，2组独立样本间比较用t检验分析。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果
4.1 补阳还五汤及其精简方对大鼠药效指标的影响
造模后SD大鼠均存在较大程度的神经功能障碍，经药物干预7 d后，神经功能得到一定程度的改善。

术后7 d，除假手术组外，其他各组均有梗死灶，皮层下偶有损伤。

结果表明，模型组大鼠脑梗死面积均值高达20.85%。

补阳还五汤及其精简方组皮层梗死面积显著低于模型组（P＜0.05），但2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

脑含水量是反映脑水肿程度的常用指标，模型组大鼠脑含水量增加，引起脑组织膨胀，颜色苍白，脑沟变浅，且细胞肿胀，间隙减少，最终导致神经细胞死亡而影响神经功能。

药物干预7 d后，补阳还五汤及其精简方组大鼠脑含水量均降低，脑水肿程度改善，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

造模后，假手术组大鼠体质量呈持续上升趋势；给药后7 d后，给药组大鼠体质量亦有上升趋势，其中精简方组略优于补阳还五汤组，与假手术组趋势接近，明显优于模型组。

结果表明，补阳还五汤及其精简方组均有助于大鼠脑缺血后体质量的恢复，由此我们推测，两方可能通过抵抗大鼠脑缺血后胃肠道应激反应达到保护胃肠功能。

4.2 补阳还五汤及其精简方对氧化应激损伤模型细胞的影响
采用H2O2建立体外细胞氧化应激模型，结果表明，①一定浓度范围内，H2O2对PC12细胞损伤存在浓度依耐性，0.2 mmol/L的H2O2对细胞损伤非常小，仅有少量细胞变圆，细胞存活率与正常组相当；随着浓度的升高，细胞发生聚集、脱落，呈弥漫状，细胞存活率也呈线性降低；当损伤浓度升高至1.0 mmol/L，镜下视野几乎无细胞存活。

结果见图1。

考虑到高浓度H2O2的严重致损作用，我们选取0.3 mmol/L的H2O2作为氧化应激模型的损伤浓度。

②H2O2致PC12细胞损伤具有时间饱和效应，H2O2作用30 min即可出现细胞损伤，并随着时间延长，细胞存活率呈线性降低，但损伤2 h后的各时间点细胞形态变化不大，对细胞的抑制率亦相当（见图2），可能是损伤在2 h左右达到饱和，因此，确定体
外细胞氧化应激模型采用H2O2损伤时间为2 h。

一定浓度的药物干预细胞2 h后，能不同程度保护PC12细胞，增强其抗氧化损伤能力。

结果见图3。

0.2 mg/mL的药物干预即可对抗H2O2的氧化损伤，对PC12细胞发挥保护作用；在1.0 mg/mL范围内，随着药物浓度的升高进而促进细胞增殖，有效防止H2O2的过氧化作用；当药物浓度继续增大，则对细胞产生明显的毒副作用，细胞存活率显著降低。

因此确定两方对H2O2致过氧化损伤发挥保护作用的有效浓度范围为0.2～1.0 mg/mL，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但两方平行比较发现，有效作用浓度范围内的细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。

5 讨论
王清任《医林改错》明确指出：“人过半百元气已虚，气虚无力推动血行，使之瘀血偏滞于体，乃罹患偏瘫”，“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”。

本课题组遵循之方义，基于益气祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血（络）不生”和“不破不立，瘀祛新生”的观念，将补阳还五汤进行精简，方中重用原方君药黄芪，既治气虚之本，又治血瘀之标，既大补元气，又利营卫之气，通营卫之阻滞以活血；川芎能升能散，其性走窜，补而不滞，走而不守，能上行头目，旁达四肢，下行血海，血行则瘀去脉通也，使气血和顺，正所谓“血行风自灭”；地龙长于行散走窜，通经活络，为佐药。

三药合用，意即通过“活血”、“祛瘀”或“化旧”等方法来获得“生新”，从而达到瘀去新生、病愈体复的治疗目的。

为更好发挥中药复方的整体功效，减少传统汤剂在煎煮过程中有效成分的丢失，本课题组将超临界CO2流体萃取法和醇提、水煎工艺相结合，对精简方药材进行提取，保证中药有效成分最大限度的溶出。

本研究一方面采用体内MCAO动物模型，通过对脑梗死面积、脑组织含水量和大鼠体质量等指标的测定比较了补阳还五汤及其精简方在抗脑缺血损伤方面的功效，结果表明，补阳还五汤精简方能减少脑梗死面积、减轻脑组织水肿、增加大鼠体质量。

PC12细胞是从大鼠肾上腺髓质瘤中分离得到的一种交感样前体细胞株，在形态、生理、生化功能方面具有神经元细胞的特征，高分化的PC12细胞具有类似神经元的表达和突触，为国内外研究脑缺血所致的神经元损伤的理想替代模型[7]。

采用0.3 mmol/L的H2O2与PC12细胞共同作用2 h，复制脑缺血体外氧化应激细胞模型，对补阳还五汤及其精简方在抗脑缺血损伤方面的功效进行实验验证，结果表明，两方在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内均能有效抑制H2O2对PC12细胞的损伤作用。

体内外实验结果均提示基于益气祛瘀生新法在补阳还五汤基础上筛选出的精简方是合理有效的，这可能是由于其精简方采用的现代制备工艺和设备能更大程度地将药材中的有效成分溶出，在不改变药效的前提下有效节约中药资源。

本实验分别从体内动物和体外细胞两个角度证实了补阳还五汤精简方对脑缺血损伤疗效显著，下一步将重点探究补阳还五汤精简方抗脑缺血损伤的分子机制及其在体内的药代动力学特征，为补阳还五汤精简方的新药申报工作奠定实验
基础。

参考文献：
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