人表皮干细胞的培养技术

人表皮干细胞的培养技术【关键词】表皮干细胞; 细胞培养; 细胞传代
近年来，人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点，表皮干细胞即是其中之一。

表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1]。

随着人口老龄化速度加快，慢性溃疡及皮肤病患者日益增多，加之烧伤及意外创伤造成的皮肤缺损，临床对皮肤移植的需求越来越大。

由于表皮干细胞数量少，缺乏明确的特异性分子标志，体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，增加了分离培养的难度。

获得大量高纯度的表皮干细胞成为该领域研究的关键技术。

我们根据几年来在细胞培养方面的工作实践，将人表皮干细胞的培养技术总结如下。

1 人表皮干细胞的分离与培养
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。

取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5
cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。

剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。

滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。

加入表皮干细胞培养基(每100 ml K��SFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml)并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。

倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用D��Hank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。

培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。

钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。

我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。

在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。

为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。

托盘始终装有一定量的饱和浓度磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。

2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。

用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。

加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。

传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。

3 人表皮干细胞的冻存
细胞不用或保种时，可将细胞冷冻保存在液氮中。

细胞在培养基中直接降温冷冻，可因细胞内、外环境中的水而形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、渗透压改变、蛋白变性等，从而引起细胞死亡。

因此，细胞培养基中要加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油。

为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。

一般用第2代人表皮干细胞培养至对数生长期时，用含胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成5×106 /ml 的细胞悬液，1 000转/min，离心10 min，弃去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的冻存液，用吸管小心吹打，重新悬浮细胞，分装于2 ml冻存管中，将盖拧紧，用记号笔记好细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人等。

放入-70℃冰箱过夜后，再转入液氮罐中保存。

注意：用于冻存的细胞应在光镜下观察生长状态良好，冻存细胞的体积不要超过冻存管体积的1/2。

4 人表皮干细胞的复苏
从液氮中取出冻存管后，迅速投入预先准备的40～42℃水中，并不时摇动，让细胞冻存液快速解冻1 min左右。

取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出细胞悬液，加至10 ml离心管中，补加含胎牛血清的DMEM培养液，小心吹打使细胞分散悬浮。

1 000转/min，低速离心10 min，弃去上清，加入表皮干细胞用的条件培养基适当稀释后，转入IV型胶原预铺的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和水蒸汽培养箱中培养。

复苏后要每天观察细胞状态，待细胞生长至适当密度时，及时分瓶培养或实验待用。

人表皮干细胞培养技术发展迅速，但诸如细胞在体外培养容易变形，多次传代后细胞克隆形成率明显下降，细胞逐渐分化难以保持原代细胞特性等问题，还有待更好地解决。

参考文献
1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，
109 (Pt 5): 1017��1028.
2 Kim DS，Cho HJ，Choi HR，et al.Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents.Cell Mol Life Sci，2004，61(21): 2774��2781.
3 斯佩克特DL，戈德曼RD，莱因万德LA.黄培堂译.细胞实验指南(上册).北京：科学出版社，2001.2��3.
4 蔡文琴.现代实用细胞与分子生物学实验技术.北京：人民军医出版社，2003.4��8.。