抑菌效力验证方案-模板

附件1-XXXXX滴眼液抑菌效力测定方法验证方案
1.目的：
建立XXXXX滴眼液抑菌效力测定中残留菌数检查方法，确认该方法适合于该药品的抑菌效力测定。

2.准备
2.2 菌种
2.3 实验器材
净化工作台型号：SW-CJ-1A 标准型厂家：吴江炀明空调净化有限公司
隔水式电热恒温箱：GHP-9270型，厂家：上海一恒科技有限公司
霉菌培养箱：MJ-250-I型，厂家：上海一恒科技有限公司
卧式圆形压力蒸汽灭菌器：YXQ-WYZZ-600型，厂家：上海华线医用核子仪器有限公司酸度计：PHS-2C，厂家：上海仪电科学股份有限公司
一次性薄膜过滤集菌培养器：PY220型，厂家：浙江泰林生物技术股份有限公司
3.菌液制备：
接种新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经30℃～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液（培养基适用性以及计数方法验证用菌液浓度为小于100cfu/ml；抑菌效力检查试验用菌液约为108cfu/ml）。

取新鲜的白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20℃～25℃培养24～48小时，用0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液（培养基适用性以及计数方法验证用菌液浓度为小于100cfu/ml；抑菌效力检查试验用菌液约为108cfu/ml）。

取新鲜的黑曲霉培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经20℃～25℃培养5～7天，或直到获得丰富的孢子。

加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液（培养基适用性以及计数方法验证用菌液浓度为小于100cfu/ml；抑菌效力检查试验用菌液约为108cfu/ml）。

菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2〜8 ℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2〜8℃，在验证过的贮存期内使用。

4.培养基的适用性检查。

胰酪大豆胨琼脂培养基适用性检査分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的菌液至胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平板，混匀，凝固，置30〜35℃：培养不超过3 天，计数；沙氏葡萄糖琼脂培养基分别接种不大于lOOcfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平板，混匀，凝固，置20〜25℃培养不超过5 天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

表- 1 培养基适用性检查
结论：
5. 残留菌数测定方法验证
5.1 预验证试验操作：
按照中国药典2015
年版四部通则1121要求进行。

试验组：第一组：取供试品1ml 和相应试验菌＜100cfu 直接接种法加入相应培养基。

第二、三组：取供试品1ml 加入盛有100mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的滤杯中，按薄膜过滤法操作，过滤，然后按需加入PH7.0氯化钠- 蛋白胨缓冲液及50-100cfu 试验菌，冲洗n 次。

取出滤膜贴于相应菌的培养基上。

菌液对照组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。

供试品对照组：同试验组操作，以稀释液代替试验菌。

细菌于胰酪胨大豆琼脂培养基中，30-35℃培养3天；霉菌酵母菌于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃培养5天。

表- 2残留菌数测定方法验证预试验
结论：可用第X组方法处理样品进行计数试验。

5.2第X组样品处理方法计数重复试验验证结果：
表- 3 计数方法验证结果
5.3 结论
由试验结果可见，供试品在xxxxx检验条件下在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率及各试验组的菌数回收率均大于70%，本品可照此检查法和检查条件进行供试品抑菌效力测定时残留菌数的测定。

6.接种试验平行性验证
取制备好的各108cfu/ml的菌液不得过0.05ml至5ml稀释剂中，每种菌平行配置两份，每份平行做两个平皿。

稀释至10-5、10-6、10-7倍，取1ml至相应的培养基中，细菌于胰酪胨大豆琼脂培养基中，30-35℃培养3天；霉菌酵母菌于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20-25℃培养5天，计数。

平行样品间回收率应大于70%。

表- 4 接种试验平行性验证
结论：
7.供试品检查：
7.1 菌液制备按照3（P2）进行菌液制备为108cfu/ml的菌液，并同接种实验操作，以5ml 稀释液代替供试品，每ml稀释液中的菌数即为7.2试验中每ml供试品中的接种数。

7.2 接种取包装完整的供试品（5ml/支）至少5份，直接接种试验菌（若试验菌株数超过5 株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种—种试验菌（接种108cfu/ml的菌液不得过0.05ml），lg或lm l供试品中接菌量为105~106cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的1% ，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布，然后置20〜25℃避光贮存。

7.3 存活菌数测定按下表规定的间隔时间，分别从上述每个容器中取供试品lml(g )，测定每份供试品中所含的菌数，测定细菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。

存活菌数测定方法按照经验证的方法进行。

根据存活菌数测定结果，计算lml(g )供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。

结果判断供试品抑菌效力评价标准见下表，表中的“减少的lg值”是指各间隔时间测定的菌数lg值与lml( g )供试
品中接种的菌数lg值的相差值。

表中“A”是指应达到的抑菌效力标准，特殊情况下，如抑菌剂可能增加不良反应的风险，则至少应达到“B”的抑菌效力标准。

表- 5判断标准
减少的lg值
6h 24h 7d 14d 28d
细菌 A 2 3 -- -- NR
B -- 1 3 -- NI
真菌 A -- -- 2 -- NI
B -- -- -- 1 NI
注：N R：试验菌未恢复生长。

N I：未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数童不超过0.5 lg。

7.4 供试品检查结果
表- 6 检查结果
批号菌
减少的lg值
6h 24h 7d 14d 28d
Y0181702 细菌-- 真菌-- --
Y0181703 细菌-- 真菌-- --
Y0181704 细菌-- 真菌-- --
结论：。