第十七章病理学常用技术的原理及应用

着在固相载体上的高密度的DNA微点阵。就是 将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度 地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等 载体上，这就是基因芯片。一套完整的基因芯 片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计 算机及生物信息软件处理系统等。
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基因芯片的分类和工作原理
按基因芯片的功能分：表达谱基因芯片、诊断 芯片和检测芯片，前者主要用于基因功能的研 究；后两者可用于遗传病、代谢病和某些肿瘤 的诊断或病原微生物的检测等。 表达谱基因芯片检测的基本原理：用不同的荧 光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA分 别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的 DNA片段进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长 扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中 的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因 在不同组织中表达差异的重要信息。
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谢谢！
祝同学基因芯片的应用：
基础研究方面有基因表达谱分析、基因分 型、基因突变的检测、新基因的寻找、遗传作 图和重测序等；临床上可用于抗生素和抗肿瘤 药物的筛选和疾病的诊断等方面。
利用基因芯片可以大规模、高通量地对成 千上万个基因同时进行研究，从而解决了传统 的核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、 操作序列数量少和检测效率低等问题。
组织芯片的特点是体积小、信息含量大，并可 根据不同的需求进行组合并制成各种组织芯片，能 高效、快速和低消耗地进行各种原位组织学的研究 和观察，如形态组织芯片制作流程学、免疫组织化 学、原位杂交和原位PCR等。在科研工作中可单独 或与基因芯片配套用于基因及其蛋白表达产物的分 析和基因功能的研究；还可作为组织学和病理学实 习教材、外科病理微缩图谱。
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第六节 显微切割术
显微切割术是90年代初发展起来的 一门新技术，能够从组织切片或细胞涂 片上的任一区域内切割下几百个、几十 个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有 关 的 分 子 生 物 学 方 面 的 研 究 ， 如 PCR， PCR-SSCP及比较基因组杂交等。
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材料：冰冻或石蜡包埋组织切片或细胞涂片。切片
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1、免疫组织化学染色方法 按标记物性质分：荧光法、酶法、
免疫金、银及铁标记技术等。 按染色步骤分：直接法、间接法。 按结合方式分：抗原-抗体结合法、
亲和连接法、标记的链亲和素-生物 素法等。
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2、免疫组化染色的质量控制和结果 阳性表达方式：
（1）胞浆阳性 （2）核周胞浆阳性 （3）胞浆局限性点状阳性 （4）细胞膜阳性 （5）细胞核阳性
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存在的问题： ①特异性不高，特别是假阳性的问题。产
生的原因有引物与模板的错配、在扩增中因 细胞内受损伤DNA的修复而形成的非特异性 序列和特异性扩增序列的弥散等。
②技术操作复杂，影响因素太多。 ③需要特殊的设备，即原位PCR仪，价格 昂贵。
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第五节核酸原位杂交
原位杂交是核酸分子杂交的一部分，是 将组织化学与分子生物学技术相结合来检测 和定位核酸的技术。用标记了的已知序列的 核苷酸片段作为探针，通过杂交直接在组织 切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定 位某一特定的靶DNA或RNA的存在。其生物 化学基础是DNA变性、复性和碱基互补配对 结合。根据所选用的探针和待检靶序列的不 同，有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和 RNA-RNA杂交。
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原位杂交的主要程序
实验材料：常规石蜡包埋组织切片、冰冻 组织切片、细胞涂片和培养细胞爬片等。
主要程序：包括杂交前准备、预处理、杂 交、杂交后处理-清洗和杂交体的检测等。
应注意的问题：①DNA-RNA杂交和RNARNA 杂 交 ， 需 灭 活 RNA 酶 处 理 ； 使 用 双 链 cDNA探针和/或待测靶序列是DNA时，需进行 变性处理使DNA解链；②杂交温度应低于杂交 体的解链温度(Tm)25度左右；③对照实验：有 组织对照、探针对照、杂交反应体系对照和检 测系统的对照等，根据具体情况选用。
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原位PCR技术的应用及存在的问题
应用：原位PCR技术能用于低拷贝的
内源性基因的检测和定位，可用于基因 突变、基因重排和染色体易位等的研究 和观察；还可用于外源性基因的检测和 定位，如对各种感染性疾病病原的基因 检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝 炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒 基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等； 在临床上还可用于对接受了基因治疗患 者体内导人基因的检测等。
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荧光原位杂交
可以用直接法或间接法进行，直接法 以荧光素直接标记已知DNA探针，间接 法以非荧光标记物标记已知DNA探针， 再桥连一个荧光标记的抗体。
本法是一种DNA-DNA杂交，实验材 料可以是间期细胞、分裂中期的染色体， 也可以是冰冻或石蜡切片等。探针有不 同的类型，如重复序列探针、位点特异 性探针和全染色体探针等，目前已有大 量商品化的荧光标记探针。
大家好
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病理学常用技术的原 理及应用
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第一节 大体与组织病理学技术
大体观察—主要运用肉眼或辅以放大镜、 量尺和磅秤等工具，对大体标本及其病变性 状进行细致的观察和检测。
组织和细胞学观察— 将病变组织制成切片 染色，或脱落、穿刺细胞涂片染色，显微镜 观察。
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第二节 组织化学与免疫组织化学
（一） 组织化学
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原位PCR技术方法
原位PCR技术有直接法原位PCR、间接法 原位PCR、原位反转录PCR和原位再生式序列 复制反应等方法，其中应用相对较广泛的是间 接原位PCR方法。
主要程序有组织固定、预处理(如蛋白酶K 和RNA酶消化)、原位扩增及扩增产物的原位 杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增 产物作检测，使该方法的特异性较直接法高。
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意义：可从构成复杂的组织中获得
某一特定的同类细胞或单个细胞，适用 于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克 隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶 段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞 内某些酶活性的定量检测等。不足之处 是技术难度大；需特殊的设备，激光器 造价高。
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第七节 生物芯片技术
(一)基因芯片 基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)，是指固
免疫组化技术可用于各种蛋白质或肽类物 质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴 细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研 究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以 及细胞周期和信号转导的研究等。
免疫组织化学染色技术也是非放射性原
位杂交、原位PCR和原位末端标记DNA片段
等技术的基础。
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第三节 电子显微镜技术
实验材料是从新鲜组织或培养细胞中提取 的mRNA，对外周血或培养细胞样本的研究相 对容易，对实体瘤的研究受到限制。
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蛋白质芯片
蛋白质芯片是继基因芯片之后发展起来的 对基因功能产物表达水平检测的技术。也是在 一个载体上点布高密度不同种类的蛋白质，再 用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的 抗体或配体一起同芯片上蛋白质竞争结合，在 扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算 出待测样本结果。
一般称特殊染色，通过应用某些组织化 学成分特异性结合的显色试剂，显示病变组 织细胞的化学成分(如蛋白质、酶类、核酸、 糖类、脂类等），从而加深对形态结构和代 谢改变的认识，弄清形态改变与代谢改变的 关系。如过碘酸Schiff反应（PAS）或区别骨 Ewing肉瘤和淋巴瘤，前者胞浆内含有糖原呈 阳性，后者阴性，磷钨酸苏木精染色可显示 横纹肌肉瘤中瘤细胞胞浆中的横纹。
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探针的选择和标记 用于原位杂交的探针有双链cDNA探针、
单链cDNA探针、单链cRNA探针和合成的寡 核苷酸探针等。
探针的长度以50-300个碱基为宜，用于染 色体原位杂交的探针可为1.2～1.5kb。探针 标记物有放射性同位素如3H、35S、32p等， 这类探针的敏感性高；非放射性探针标记物 有荧光素、地高辛和生物素等，其敏感性不 如放射性标记探针，但有性能稳定、操作简 便、成本低和耗时短等优点。
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肌动蛋
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雄激素受体
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CD3-T细胞
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雌激素受体（ER）
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影响免疫组化染色质量的因素： 取材及固定 抗体质量 抗原封闭和修复 技术操作
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3、免疫组化的应用
大量商品化的单克隆和多克隆抗体出现、 配套试剂盒的使用及方法学的不断完善，使 免疫组织化学染色已经成为医学基础研究和 病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。
透射电子显微镜是最早、最广泛应 用于医学领域的一种电镜，以后又相继 诞生了扫描电镜、超高压电镜等。电镜 的使用大大地开阔了我们的视野，看清 了细胞膜和细胞浆内的各种细胞器和细 胞核的细微结构及其病理变化，并由此 产生了亚细胞结构病理学，又称超微结 构病理学。
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电镜技术的应用
在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方 面的研究和观察；在临床上可用于多种疾病亚 细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾 病及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来 源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或 多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细 胞凋亡的形态学描述也是源于电镜的观察。
检测容量已达一万三千多个点，并实现了 整个过程全自动化检测，具有高效率、低成本 的特点，尤其适合于蛋白表达的大规模、多种 类筛查，并能用于受体—配体、多种感染因素 的筛查和肿瘤的诊断。
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组织芯片
组织芯片是将数十个至数百个小的组织片整齐 地排列在某一载体上(通常是载玻片)而成的微缩组 织切片。制作流程主要包括组织筛选和定位、阵列 蜡块的制作和切片等步骤。
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（二）免疫组织化学
是利用抗原抗体的特异性结合反应 来检测和定位组织或细胞中的某种化学 物质的一种技术，有较高的敏感性和特 异性，能将形态学改变与功能、代谢变 化结合起来，直接在组织切片、细胞涂 片、培养细胞爬片上定位某些蛋白质或 多肽类物质，结合计算机图像分析技术 或激光扫描共聚显微术等，对被检物质 进行定量分析。
的厚度为4-10um，冰冻切片需经甲醛或乙醇固定。 用于显微切割的组织切片必须染色，以便于进行目 标细胞群或单一细胞的定位。
操作方法：有手工操作法和激光显微切割法。激光
捕获显微切割技术的基本原理是：将组织切片放在 倒置显微镜的载物台上，激光束从切片的上方垂直 照射下来，落在要切割的区域。该区的乙烯乙酸乙 烯酯膜受激光照射后，瞬间温度升高并与其下方的 细胞相粘连；当将膜揭起来时，与之相连的细胞也 随之被完好地从切片上切割下来；将带有细胞的膜 放入试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也 将细胞裂解，获得待提物质，如DNA、RNA或蛋 白质等。
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原位杂交技术的应用
原位杂交可应用于：①细胞特异性mRNA 转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基 因组进化的研究；②感染组织中病毒DNA／ RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及 各种功能基因在转录水平的表达及其变化的 检测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染 色体的变化，如染色体数量异常和染色体易 位等；⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗 传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的 确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
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第四节原位多聚酶链式反应技术
原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反 应(polymerase chain reaction，PCR)技术的一 部分，是在体外经酶促反应将某一特定DNA序 列进行高效、快速扩增，它可将单一拷贝或低 拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规 方法可检测的水平。原位PCR(in situ PCR)技术 是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织 学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、 细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸 的技术。
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随着电镜技术的不断发展，以及与其 他方法的综合使用，还出现了免疫电镜、 电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术 及全息显微术等。
电镜技术也有其局限性，如电镜设备 昂贵、样本制备较复杂、实验费用较高； 另外，由于样本取材少，观察范围有限， 有时还可能会遗漏信息；当用于辅助肿 瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的 来源，不能确定肿瘤的良恶性。