细菌的检查与防治原则

雷伯、阴沟肠杆菌多阳性
细菌的生理生化特征检测
接种菌，可 产生淀粉酶
▪ 碳水化合物的代谢试验
▪ 淀粉水解试验 【原理】 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水 解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不 再变蓝色，而在菌落周围出现透明圈。
▪ 白喉棒状杆菌可产生淀粉酶，分解淀粉。
细菌的生理生化特征检测
▪ 碳水化合物的代谢试验
(2) 气袋法 此种方法不需要特殊设备,操作简单,使用方便,不但实验室中可用,而且外出采样,现场接 种也可用.原理与气体发生袋完全相同,只是采用塑料袋代替了厌氧罐,气袋为一透明而密闭的塑料袋,内 装有气体发生安瓿,指示剂安瓿,含有催化剂的带孔塑料管各一支.其操作方法为首先将接种的平板培养基 放入袋中,用弹簧夹夹紧袋口,然后用手指压碎气体安瓿,20分钟后再压碎指示剂安瓿,如果指示剂不变蓝 色,说明袋内达到厌氧状态,即可放入37℃进行培养.
第七章 感染病病原学诊断与预防
教学目的:掌握标本采集的原则、标
本的处理方法及常用实验诊断技术。
▪ 细菌 ▪ 真菌 ▪ 病毒
感染病
如何诊断？
第一节 细菌感染病病原学检查
尽早采集 直接关系到检测的准确性 选择不同采集时机和标本种类 标本的采集和送检六原则 在抗生素应用前采集
遵守无菌操作 正确的保存和运送 作好标记,化验单核对
细菌的生理生化特征检测
▪ 碳水化合物的代谢试验
▪ 糖（醇、苷）类发酵试验 【原理】 兼性厌氧菌和厌氧菌一般都能发酵糖类，不 同细菌分解糖类后产生的代谢产物因菌种而 异，有的仅产酸，有的产酸产气，据此来鉴 别细菌。如大肠杆菌既可发酵葡萄糖也可发 酵乳糖，沙门菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖。
糖发酵试验
气泡
▪ 2）接种工具和场所：①接种针和接种环是细菌学实验室必需的工具② 接种罩、无菌工作台、无菌室、生物安全柜是为了达到无菌技术要求而 建立的细菌接种场所。
培养基
培养基（culture medium）供细菌生长用的，由人工方
法将多种营养物质根据细菌的需要组合成的混合营养基 质。
常用培养基种类
（culture medium）
▪ 意义：用于细菌种属间的鉴别。肠杆菌科细菌为发酵型，非 发酵菌通常为氧化型或产碱型，微球菌属可氧化葡萄糖，葡 萄球菌属则能发酵葡萄糖。
七叶苷水解试验
▪ 原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的 枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色
▪ 方法：将待测菌接种于七叶苷培养基，培养后观察结果 ▪ 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性 ▪ 意义：肠球菌、D群链球菌与其他链球菌的区别，前者为阳性；肺炎克
气体发生袋法:气体发生袋系由锡箔密封包装,其中含有两种药片,一种为含枸椽酸和重碳酸氢钠的药 片,另一种是含有硼氢化钠的药片.前者遇水放出二氧化碳,后者可释放氢.使用时在袋的右上角剪一小口, 灌进10ml蒸馏水,立即放入含有钯粒,指示剂及平板培养基的厌氧罐中,拧紧盖子经2-3分钟后,可感到盖子 微热并有少量水蒸气出现.密封后1小时左右罐中的O2 的含量可低于<1%.
▪ 6）生殖道标本：正常的内生殖器官是无菌的，但外生殖器可有正常菌 群的存在，在菌群失调时也可发生真菌性阴道炎、细菌性阴道炎或尿道 炎等疾病。
▪ 解剖结构的不同男性和女性生殖道采集的标本有： ▪ ①男性尿道、生殖道分泌物，前列腺液标本 ▪ ②阴道后穹窿分泌物及经阴道后穹窿穿刺盆腔脓液 ▪ ③外阴分泌物 ▪ ④采用双套管的方式插入子宫腔吸取分泌物 ▪ 7）脓液、胸腹水及分泌物等其他标本。
细菌的培养方法
▪ 3）厌氧培养法 目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法,气袋法及厌氧箱三种. (1) 厌氧罐法 是目前应用较广泛的一种方法,共分为以下几种. 抽气换气法:该法适用于一般实验室,其特点是较经济并可迅速建立厌氧环境.标本接种后,将平板放
入厌氧罐,拧紧盖子,用真空泵抽出罐中空气,使压力真空表至-79.98KPa,停止抽气,充入高纯氮气使压力 真空表指针回0位,连续反复3次,最后在罐内-79.98KPa的情况下,充入70%的N2 ,20%H2 ,10%CO2 (有人 改用20%CO2 及80%H2 ,亦可获得好结果).罐中需放入冷催化剂钯粒,可催化罐中残余的O2 和H2 化合 成水.同时罐中应放有美蓝指示管,美蓝在有氧的环境下呈蓝色,无氧时为红色.临用前首先将美蓝煮沸使 变成无色,放入罐中先呈浅蓝色,待罐中无氧环境形成,美蓝即可持续无色.
平板划线接种
待分离标 本涂布点
第一次划线区
第二次 划线区
第三次 划线区
平板划线接种
细菌的分离接种法
斜面接种（用于已获得的单个菌落的移种、纯种培 养细菌和保存菌种及观察细菌的某些特性）
细菌的分离接种法
液体接种法（用于增菌培养）
细菌的分离接种法
穿刺接种法:此法主要用于半固体培养 基、明胶及双糖管的接种。用接种针 取细菌少许，从半固体培养基中央， 平行于管壁垂直刺入，接近管底但不 可接触管底，然后接种针沿原路退出
特殊培养基
选择培养基
营养培养基
鉴别培养基
基础培养基
培养基的制备过程
▪ 称量 溶解 调PH ▪ 灭菌 质量检验
过滤 分装 保存
细菌的分离接种法
平板划线接种（使标本中混在的多种 细菌在培养基表面分散生长，形成各 自菌落。便于根据菌落特征，挑取单 个菌落进行纯培养）
细菌的分离接种法 平板划线接种
细菌的分离接种法
▪ 染色标本的形态检查： ▪ 1）染色的原理和染料 ▪ 2）常用染料：酸性、碱性、复合、单纯染料等 ▪ 3）染色方法：单染法、复染法（革兰染色、抗酸染色）、特殊染色
致病菌的分离鉴定
涂片检查---染色和不染色--- 初步诊断
分离培养
生化试验
明
确
血清学鉴定
诊
动物试验
断
药物敏感试验
分子生物学技术
病原菌抗原检测—EIA、协同凝集试验、IF、CIE等
VP试验
（—）
（+）
葡萄糖 丙酮酸
乙酰甲基甲醇
红色
OH-
二乙酰 +
含胍基 化合物
VP试验
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 →二乙酰→红色化合物 + 胍基化合物
葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇
-
-+
细菌的生理生化特征检测
▪ 蛋白质和氨基酸的代谢试验：不同细菌分解蛋白质能力不同， 可用于鉴别细菌。
常见的临床标本
▪ 4）脑脊液标本：正常人脑脊液是无菌的，从脑脊液中检出细菌均应作 为病原菌看待。
▪ 5）粪便标本：肠道内有种类和数量很多的正常菌群，因此粪便标本中 包含有大量的正常菌群，通常需用选择培养基分离致病菌，此外菌群失 调和菌交替症也可引起腹泻，因此对正常菌群的种类和比例的检查是不 可或缺的。
细菌的分离接种法
常用于纸片法药 物敏感性测定， 也可用于被检标 本中的细菌计数。
测定牛乳、饮水和尿液等标本细 菌数时常用此方法。
细菌的培养方法
▪ 1）普通培养法 ：是指需氧菌或兼性厌氧菌等在普通大气环境下的培养条件，又称需氧培 养法。将已接种过的培养基,置35℃培养箱内18-24小时, 即可于培养基上生长.少数生长缓 慢的细菌,需培养3-7天直至一个月才能生长.为使培养箱内保持一定湿度,可在其内放置一杯 水.培养时间较长的培养基,接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固,以防培养基干裂. 2）二氧化碳培养法 ：某些细菌,如布氏杆菌和脑膜炎奈瑟菌等需要在含有10%二氧化碳的 空气中才能生长,尤其是初代分离培养要求更为严格.将已接种的培养基置于二氧化碳环境 中进行培养的方法即二氧化碳培养法,常用方法有以下几种: (1) 二氧化碳培养箱 可将已接种的培养基直接放入箱内孵育,即可获得二氧化碳环境. (2) 烛缸法 将已接种的培养基,置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内.缸盖或缸 口处均需涂以凡士林,然后点燃蜡烛直立置入缸中,密封缸盖.待燃自行熄灭时,容器内约含510%的CO2 容器置37℃培养. (3) 重碳酸钠-盐酸法 每升容积的容器内,重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例,分别将 两种药各置一器皿内(如平皿内),连同器皿置于标本缸或干燥器内,盖严后使容器倾斜,两种 药品接触后即可产生二氧化碳.
不发酵 产酸 产酸产气
—+
+
细菌的生理生化特征检测
▪ 碳水化合物的代谢试验
▪ 氧化-发酵试验（O-F试验） 【原理】 细菌在分解葡萄糖的过程中，必须以分子氧作为电子受体的 称为氧化型。这类细菌通常是专性需氧菌，在无氧环境中不 能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧 酵解的，称为发酵型，此类细菌无论在有氧或无氧环境中都 能分解葡萄糖，通常为兼性厌氧菌。不分解葡萄糖的细菌， 称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型，
(3) 厌氧培养箱 使用之前须仔细检查厌氧装备有无漏气等问题,以及催化剂,指示剂质量等.使用时严 格遵守操作规程,保证箱内气体比例合理.
致病菌的分离鉴定
涂片检查---染色和不染色--- 初步诊断
分离培养
生化试验
明
确
血清学鉴定
诊
动物试验
断
药物敏感试验
分子生物学技术
病原菌抗原检测—EIA、协同凝集试验、IF、CIE等
细菌的接种与分离培养
▪ 为了能鉴定和研究细菌，需要对细菌进行分离培养。大多数细菌可用人 工方法培养，根据不同细菌给予适宜的培养条件，遵守实验操作的要求 可以对细菌进行分离培养。
▪ 1）无菌技术：细菌广泛存在于自然界中，如果环境或工作人员的皮肤、 黏膜中的细菌混入检验标本或污染实验材料，将严重影响检验结果的正 确性。另外，临床标本都是具有感染性的含有病原体的传染源，如处理 不当，容易引起实验室感染和医院感染，甚至严重的传染病大流行，因 此在细菌学检验时必须随时防止标本污染和病原菌扩散的操作，即无菌 技术或无菌操作。
▪ 一、苯丙氨酸脱氨酶试验 【原理】 细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨 酸脱氨变成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮 酸螯合后变为绿色 。
▪ 主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
甲基红试验
（—）
（+）
葡萄糖
丙酮酸 pH<4.4 （指示剂红色）
乙酰甲基甲醇 pH值>6.2 （指示剂黄色）
M - 甲基红（methyl red）实验
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
甲基红 甲基红 +
-
+
细菌的生理生化特征检测
▪ 碳水化合物的代谢试验
▪ 3）尿液标本：正常人尿液是无菌的。但在前尿道有正常菌群和过路菌 存在（大肠埃希菌、葡萄球菌），而后者又是常见尿路感染的病原菌。 因此正确的采集尿液，避免其他菌群的污染是尿液细菌检验正确与否的 关键。一些抗菌药物和代谢产物通过尿液排泄，因此尿液标本必须在使 用抗菌药物之前采集。女性月经期不易采集标本。常用的尿液细菌培养 标本包括中段尿、肾盂尿、膀胱穿刺尿及晨尿。
常见的临床标本
▪ 1）血液标本：正常人的血液是无菌的。采集血液标本主要用于病原体 培养、核酸检测及血清中抗原抗体检测。
▪ 2）呼吸道标本：上呼吸道有正常菌群的存在，进行普通培养无特别意 义，仅在疑似化脓性扁桃体炎、白喉、百日咳患者及脑膜炎奈瑟菌带菌 者的检查时，采集咽拭子、鼻咽拭子或化脓部位的分泌物，下呼吸道正 常情况下无菌或仅有少量细菌侵入，但很快被清除。怀疑有支气管炎、 肺炎及结核病的患者需采集下呼吸道标本，包括痰液、支气管灌洗液和 气管镜毛刷等。采集下呼吸道标本应防止上呼吸道正常菌群的污染。
▪ 甲基红试验 【原理】 细菌在代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸，某些细 菌可进一步将丙酮酸分解为乳酸，琥珀酸、醋酸和 甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至 pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。（阳性）有些 细菌分解葡萄糖产酸量少，或进一步将酸转化为其 他物质如醇、酮、醛、气体和水，则培养基的PH在 6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）。
致病菌的分离鉴定
涂片检查---染色和不染色--- 初步诊断Fra bibliotek分离培养
生化试验
明
确
血清学鉴定
诊
动物试验
断
药物敏感试验
分子生物学技术
病原菌抗原检测—EIA、协同凝集试验、IF、CIE等
涂片检查
▪ 不染色标本的形态检查：观察细菌的动力及运动等活体状况。常用的方 法有悬滴法、压滴法，该法不能看清细菌的形态结构特征。
▪ 五、V-P试验 【原理】 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧成乙酰甲基甲醇， 后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰， 二乙酰与培养基中的精氨酸所含的胍基发生反应， 生成红色化合物，称V－P（+）反应。
▪ 与甲基红试验一起使用，甲基红试验阳性，则V-P 试验阴性。反之也如此。