东北民猪源停乳链球菌的分离鉴定与药敏试验

中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６１１；Ｓ８５８．２８
文 献 标 识 码 ：Ｂ
文 章 编 号 ：１００７５０３８（２０１９）０８０１２６０５
停 乳 链 球 菌 （犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊犱狔狊犵犪犾犪犮狋犻犪犲）为 革 兰阳性球 菌，链 状 或 成 对 存 在 。 ［１］ 可 通 过 皮 肤 的 伤 口、扁桃体以及脐带等途径进入机 体血 液，进 而 导致 动物引发菌血症或败血症。该病原菌会定殖在动物 体内的一种或多种组织中，是引发 牛、山 羊 和绵 羊等 动物 的 急 性、慢 性 乳 腺 炎、关 节 炎 的 病 原 菌 之 一［２］， 其中跋行、关节 肿 大 是 其 最 显 著 和 最 持 久 的 临 床 症 状 。 ［３］
购自北京 奥 博 星 生 物 技 术 有 限 公 司；细 菌 ＤＮＡ 提 取试剂盒、胶回收试剂盒、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，ＴａＫａＲａ公 司产品；细菌通 用 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务有限公 司 合 成；生 化 鉴 定 管 （批 号 １３０５２０）、药 敏 纸片（批号１６０２１７），购 自 杭 州 天 和 微 生 物 试 剂 有 限 公司。 １．１．３ 实 验 动 物 Ｂａｌｂ／ｃ小 鼠，体 重 约 １９ｇ～２１ ｇ，由 齐 齐 哈 尔 医 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供 。 １．２ 方 法 １．２．１ 细菌 分 离 无 菌 采 集 送 检 病 死 仔 猪 的 脏 器 及关节液，接 种 于 营 养 琼 脂 培 养 基 中，３７ ℃ 恒 温 培 养１８ｈ～２４ｈ，挑取单菌落接种营养肉 汤培养基 中， ３７ ℃摇床培养１６ｈ～１８ｈ，取菌液培养液涂片、染色 镜检，同时划线接种链球菌（ＫＦ）和 麦 康 凯 鉴 别 培 养 基中，培养１８ｈ～２４ｈ，观察菌落形 态特征。 挑取典 型单菌落，接种琼脂培养基 和链球菌（ＫＦ）鉴 别 培 养 基中进行纯化培养，一部分冻干保 存菌 种，一部分 用 于进一步分析鉴定。 １．２．２ 生化 鉴 定 取 分 离 纯 化 的 细 菌 接 种 营 养 肉 汤培养基中，３７ ℃摇床培养１６ｈ～１８ｈ，取培养后的 菌液接 种 于 生 化 鉴 定 管 中，进 行 ＣＡＴ、ＣＡＭＰ、ＶＰ、
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 样品 来 源 无 菌 采 集 齐 齐 哈 尔 市 某 东 北 民 猪 养 殖 场 死 亡 仔 猪 心 脏 、肝 脏 、淋 巴 结 、关 节 液 。 １．１．２ 主要 试 剂 链 球 菌 鉴 别 培 养 基 （ＫＦ）、麦 康 凯培养基、营养 琼 脂 等 培 养 基、营 养 肉 汤 培 养 基，均
陈 楠 楠 等 ：东 北 民 猪 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 停 乳 链 球 菌 的 分 离 鉴 定 与 药 敏 试 验
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马脲酸盐水解 酶 等 系 统 的 理 化 特 性 测 定，将 生 化 鉴
定管置于３７ ℃恒温箱中培养１８ｈ～２４ｈ，也 可 按各 类 细 菌 鉴 定 方 法 所 规 定 的 时 间 进 行 培 养 ，观 察 结 果 。
２０１８ 年 ３ 月 ，黑 龙 江 齐 齐 哈 尔 某 规 模 化 东 北 民 猪 场仔猪出现 关 节 肿 大、跛 行、后 肢无法 站立 等 临 床 症 状，从送检 的 病 死 猪 肝 脏 和 关 节 液 样 本 分 离 到 病 原 菌，鉴定为停乳 链球 菌停 乳 亚种，研 究了 分 离 菌 的 致 病 性 和 药 物 敏 感 性 。 目 前 ，国 内 关 于 停 乳 链 球 菌 停 乳 亚种感染东北民猪尚未见报道。本研究为东北民猪 停乳链球菌停乳亚种病的诊断与防治提供了依据。
１．２．３ １６ＳｒＤＮＡ 鉴定 １．２．３．１ 菌 液 总 ＤＮＡ 提取 将菌 液接种 于 ３ ｍＬ 含２０ ｍＬ／Ｌ 犊 牛 血 清 的 营 养 肉 汤 培 养 基 中，于 ３７ ℃恒温摇床培养１８ｈ～２４ｈ。参照 ＴａＫａＲａ细 菌基 因组 ＤＮＡ 提取试剂 盒 说 明 书 提 取 分 离 株 的 基 因 组 ＤＮＡ。 １．２．３．２ ＰＣＲ 扩增 以基因组 ＤＮＡ 作为 模板，根 据已有的文献报道［４］，设计合成 １ 对 细 菌 通 用 引 物， 上游 ５＇ＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ３＇，下 游 ５＇ＧＧＧＣＧＧＷＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣ３＇。引物由 上 海生 工生物工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成。ＰＣＲ 反 应 体 系为２５μＬ，反应程序：９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，５０ ℃ ３０ｓ，７２ ℃ ６０ｓ，共３０个循环；最后７２ ℃ ２０ ｍｉｎ。吸 取 适 量 ＰＣＲ 扩 增 产 物，选 择 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００进行琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，紫 外 灯 观 察 电 泳 结 果 ，并 用 凝 胶 成 像 系 统 拍 照 。
摘 要：为分离东北民猪源停乳链球菌（犛狋狉犲狆狋狅犮狅犮犮狌狊犱狔狊犵犪犾犪犮狋犻犪犲）并鉴定其生物学特 性，从 齐 齐 哈 尔 市某东北民猪场死亡仔猪的肝脏及其关节液样品中分离 病原 菌，通 过 生理 生化试 验 和 分 子 生 物 学 试 验 鉴 定 分离菌，研究了分离菌的致病性和药物敏感性。结果表明，分离 到革兰 阳性 球 菌 １ 株，生 化 指 标 与 停 乳 链 球 菌 停 乳 亚 种 相 符。 系 统 进 化 树 分 析 表 明，分 离 菌 株 与 停 乳 链 球 菌 停 乳 亚 种 参 考 菌 株 的 同 源 性 为 ９７％ ～ ９８％，其中与 ＡＢ５３７９２１．１（Ｊａｐａｎ）同源性最 高，达 到 ９８．９９％，进 一 步 从 分 子 水 平 鉴 定 该 菌 为 停 乳 链 球 菌 停 乳亚种。以０．２ｍＬ／只（３．２×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）接 种 量 感 染 小 鼠，发 病 率 和 病 死 率 均 为 １００％。 分 离 菌 对 多 黏 菌素 Ｂ、阿莫西林、氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、庆 大 霉 素、氟 苯 尼 考、林 可 霉 素、新 霉 素 均 敏 感，仅 对 罗 红 霉素耐药。 关 键 词 ：猪 ；停 乳 链 球 菌 ；分 离 鉴 定 ；药 敏 试 验
动 物 医 学 进 展 ，２０１９，４０（８）：１２６１３０ ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
檲檲檲檲殘 兽医临床
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东北民猪源停乳链球菌的分离鉴定与药敏试验
陈 楠 楠 ，秦 平 伟 ，尹 臖 伊 ，王 岩 ，史 同 瑞 ，刘 宇
（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 １６１００６）
收 稿 日 期 ：２０１８０６２９ 基 金 项 目 ：黑 龙 江 省 财 政 厅 科 研 院 所 项 目 （ｓｃｚｚｎ２０１６７） 作 者 简 介 ：陈 楠 楠 （１９９０－ ），女 ，黑 龙 江 大 庆 人 ，助 理 研 究 员 ，硕 士 ，主 要 从 事 家 畜 传 染 病 与 微 生 物 学 研 究 。 通 讯 作 者