菌种的传代、保藏及菌液ppt课件

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严格控制菌种的传代
避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。 1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转 菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代） 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后， 挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管 ， 保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工 作用菌种（为第三代） 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于 试验
菌种管口移至火焰上方。
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5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼 脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照 上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至 琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从 底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面 顶端，使细菌接种在斜面的表面上。 6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上 塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰 上烧灼灭菌。 7.将已接种好的细菌管置35～37℃细菌培养 箱培养22 ～24h，霉菌管置23～28℃霉菌 培养箱培养 7天。 2019 -
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菌种的确认
一.初步鉴定试验 分离培养—菌落形态 革兰染色—菌体染色特性及菌形 生化试验—检测细菌对各种基质的代谢作 用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类
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二.全面鉴定
血清分型 毒素分析—内毒素和外毒素 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）
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4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板 和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻 保存管（第三代）斜面养基适当温度培养 后作为工作用菌种（第三代） 5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将 生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。 6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用 上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三 代）可直接 转接第四代，直至四代转为五代。
霉菌各种菌落形态
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白色念珠菌
形态特征： G＋、圆形或卵圆形、着色不均匀、
在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、
表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌 落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中 呈沉淀生长。 分离培养：快速显色培养基
位于菌体中心或次极端，不小于菌体。
培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、 可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营 养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。 分离培养：营养琼脂平板 血琼脂平板
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枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
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菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
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-Байду номын сангаас
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严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储 备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种 进行纯度和属性确认外，还应对每一次传 代都进行确认的质量控制系统。因为微生 物菌种从上一代传到下一代时，很可能发 生污染或变异，因此每次传代中至少要对 菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必 要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到 污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实 2019 验。
金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态
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金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形 态
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沙门菌
形态特征： G-直 杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有 周身鞭毛，能运动。有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养 琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、 半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中 呈均匀混浊生长。
培养所用器具
1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等
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菌种的接种操作步骤
一. 斜面接种法：
1. 从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30
分钟。
2. 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明
菌名及接种日期，和传代菌种一并移入接种室或
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微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。 2019 -
列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营
养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、
隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同 而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀 混浊生长。 分离培养：高盐甘露醇培养基
生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋ 2019 -
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白色念珠菌—显色平板的形态
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白色念珠菌—显微镜下菌体形态
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黑曲霉
形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形
放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成
菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色，
粗绒状。
分离培养：快速显色培养基
菌种的传代、保藏 及菌液制备
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标准菌种的概念及其管理
标准菌种是指由国家授权机构制备的具有 稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌 种。 我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理 委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物 检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中 心（CMCC）提供
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超净工作台。打开紫外灯照射一小时。
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3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将
管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环
烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧 灼，往返通过三次。 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口 在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种 环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后 再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。 2019 -
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3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
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黑曲霉—显微镜下菌体形态
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黑曲霉—电镜下菌体形态
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菌种传代的工作环境、工具及其他器皿
环境
1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区 域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。 2、无菌隔离舱
工具
1、接种环 2、接种针 3、接种铲 4、接种钩 5、酒精灯及其他玻璃器械
菌种的名称
铜绿假单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］

生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］ 大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］ 金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］ 沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］ 枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］ 白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］ 黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］
分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）
生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－ MUG 试验结果：荧光：＋
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大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
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大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
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大肠埃希菌—电镜下菌体形态
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金黄色葡萄球菌
形态特征： G＋球菌、呈单个、成双、短链或排
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菌种处理的注意事项与有关记录
菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类 都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于 其他标准品的特殊要求。 1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染 的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。 2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、 检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和 控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容 包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养 特性、生化检定、传代次数、最适培养基
硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、
光滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基 中常在其表面形成菌膜。
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大肠埃希菌
形态特征： G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能 运动。有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养
基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的 菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
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铜绿假单胞菌
形态特征：G-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无 芽胞、有荚膜、单端有1～3根鞭毛。 培养特性：专性需氧，最适温度为35℃，但在42 ℃生 长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通 培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不 齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。 在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成 菌膜。 分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基 生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为 紫红色） 绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）
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二. 穿刺接种法： 用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂 直刺入，接近管底但不接触管底，然后接 种针沿穿刺线原路退出。 主要用于生孢梭菌的传代。 三.液体接种法： 用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交 界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养 液中。
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黑曲霉接种方法：
黑曲霉孢子悬液，可以保存在4℃环境，并应在一个月内 尽快完成转种操作。转种操作应在超净工作台（或相当此 环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无 菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面， 用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日，培养斜面形 态可参照下图。
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枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态
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真菌的初步鉴定试验
标本直接检查—显微镜检查 真菌的分离培养 ⑴.酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般 细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、 边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成 假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。 ⑵.霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮 状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。 快速显色鉴别培养法：经37℃1～2d就能显示结 果。如白色念珠菌呈绿色或蓝绿色菌落，黑曲霉 呈白色丝状菌落，里面呈淡粉红色，一周后逐渐 变成黑色。 2019 34
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铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态
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铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态
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生孢梭菌
形态特征： G＋粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体 革兰染色为阴性 ，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体， 位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。 培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易 形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。在
分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养 基 生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产
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气，H2S阳性
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沙门菌—SS平板菌落形态
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沙门菌—显微镜下菌体形态
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沙门菌—血清凝集试验结果
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枯草芽孢杆菌
形态特征： G＋直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，
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培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指
出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培 养基加琼脂制成的培养基进行传代。 真菌一般用改良马丁培养基。
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菌种的传代
菌种的复苏
菌种的确认 菌种的接种
菌种的保藏
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菌种的复苏
《中国药典》2005版规定，所用标准菌种 的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为 第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种 后为第1代，直至到第3代为工作菌种。