无菌检查微生物限度检查方法学验证实例

供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108
110、120
54、34
3
153、150
78、 77
73、74
110、100
30、27
*
表2 复方磷酸可待因微生物限度检查方法验证 （常规法）
实验次数
人工染菌回收率%
金葡菌
枯草杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠埃希菌
1
0.02
71.4
81.1
100.0
100.0
2
29.2
29.4
供试液制备： 吸取样品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
结果 菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。
表1 菌落计数（cfu/ml）
*
实验次数
金葡菌10-5
枯草杆菌10-5
白色念珠菌10-5
黑曲霉10-4
大肠埃希菌10-7
1
94、90
130、80
73、72
110、90
14、15
2
80、74
+
+
+
+
阳性对照
+
+
+
+
+
表4 36小时观察真菌结果
*
黑曲霉菌
白色念珠菌
冲洗量200ml
+
+
冲洗量400ml
+
+
阳性对照
+
+
*
取12支样品，每2支以100ml生理盐水溶解，冲洗100ml每次，做冲300、500ml、800ml二桶，各加入硫乙醇酸盐培养基100ml和β-内酰胺酶2支。分别加入大肠杆菌菌液（肉汤培养物10倍稀释至10-7）1ml。结果见表5。
100.0
100.0
100.0
3
抑菌
抑菌
100.0
100.0
100.0
从表2结果可以看出:
*
采用常规方法检验复方磷酸可待因溶液供试品，人工污染5株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。
01
复方磷酸可待因对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有不同程度的抗菌活性，供试品回收率为0.02~29.2%，均低于70%。
薄膜过滤法：
*
取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗
01
500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃­培养3～5d，逐日观察，结果见表2、3、4。
02
*
*
无菌检查、微生物 限度检查 方法学 验证实例
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样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司 提供，批号20040305。
培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基， 批号040203；霉菌液体培养基，批号 040302； 营养肉汤培养基，批号 0403045；营养琼脂培养基，批号 040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。
20
20
均值(CFU)
24
38
64
56
20
菌 种
黑曲霉菌
白色念珠菌
计数(CFU)
86
93
86
83
均值(CFU)
89
85
*
实验结果见表3和表4 表3 细菌实验结果 (20小时观察)
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
冲洗量800ml
72h( - )
+
+
+
+
冲洗量1000ml
薄膜过滤：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。
阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及真菌培养基2桶，100ml/桶。 阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100ml，不加对照菌液，分别于30-35℃及23-28℃培养。
*
*
*
*
*
*
*
结论： 根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
*
样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶；批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
01
培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供)
02
β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号：20030630）
03
*
验证试验用菌种： （1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]； (2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102]； (4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104]； （5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]； (6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]； (7) 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。
取经24℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100cfu/ml备用。
*
取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。
取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。
方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。
菌液制备：
*
取经34℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。
大肠埃希菌菌液制备：取经35℃培养19~20h 的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取0.4ml加盐水10ml混匀，做活菌计数备用。
表5 实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU）
培养时间
14h
25h
38h
110h
冲洗量300ml
-
-
-
-
冲洗量500ml
-
-
+
+
冲洗量800ml
取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。
取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。
白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。
-
+
+
+
阳性对照
+
+
+
+
结论： 头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为0.9％的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶量2支（大于300单位/ml）以大肠埃希菌为阳性对照菌。
复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验
01
*
培养基稀释法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加15~20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。 常规法为1ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基；培养基稀释法则为0.5ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为2倍稀释，0.2ml供试液加15~20ml菌落计数用培养基为5倍稀释。
样品：复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315 、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。 验证用菌种： 枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。 方法： 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。
取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。
将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃培养5～7d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加生理盐水10ml混匀备用。
回收率测定： 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50~100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌. 活菌组 测定每一菌株的试验菌数 供试液对照 测定供试品本底菌数 稀释剂对照组
具体操作方法 菌液制备： 取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。 取经25 ℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置厌氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。
供试液制备：每2支以100ml生理盐水溶解，混匀备用。