鱼肉中硝基呋喃的检测分析
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THEORY | 理论研究
鱼肉中硝基呋喃的检测分析
DOI:10.16043/ki.cfs.2017.z2.037
硝基呋喃是一种高效抗生素药物，也被非法当做鱼、猪等 动物的生长促进剂使用。研究发现，硝基呋喃具有致癌和致突 变的作用。硝基呋喃类药物的检测方法有 ELISA 法度法、高效 液相色谱法和 HPLC-MS 法。硝基呋喃药物在体内与蛋白结 合生成的代谢物较稳定，因此检测硝基呋喃类药物一般是测定 其代谢物，其中呋喃唑酮的代谢物是 3- 氨基 -2- 噁 唑烷基酮 （AOZ）。本实验以 HPLC-MS 法为对照实验比对 ELISA 法 测定的 27 份市售鱼肉样品，从而验证 ELISA 法在硝基呋喃快 速检测中的有效性、可靠性，为食品监督执法提供参考。 器材 高效液相色谱 - 串联质谱仪（Waters TQ-S）, 酶 标仪（ThermoFisher multiskan）；离心机（Lynx 6000）, 涡 旋振荡器（pro250）, 氮吹仪。 试 剂 硝 基 呋 喃 检 测 试 剂 盒（COKDA0300），AOZ 标 准 溶 液（Sigma-Aldrich 公 司），60% 甲 醇，1mol/L 盐 酸， 50mmol/L2- 硝基苯甲醛二甲基亚砜溶液，0.1mol/L 磷酸氢二 钾溶液，1mol/L 氢氧化钠，20% 甲醇溶液，1mol/L 盐酸，2硝基苯甲醛亚甲基二砜溶液。 实 验 供 试 品 溶 液：HPLC-MS 法： 称 取 2g 样 品， 加 10mL60% 甲醇匀浆 2min，离心后弃去上清液，加 8mL 甲醇洗 涤 1 次，8mL 乙醇洗涤 1 次，8mL 乙醚洗涤 1 次。取标准溶液 AOZ 使其最终浓度 0.5、1、2、4、10ng/mL。每个离心管加 入水 4mL、1mol/L 盐酸 1mL、50mmol/L2- 硝基苯甲醛溶液 0.15mL，混匀。37℃避光 16h。加 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液 5mL，用 1mol/L 氢氧化钠调 PH=7.2~7.4。加乙酸乙酯 5mL， 涡旋 5min。离心后取上清液于 50℃氮气吹干。加 20% 甲醇溶 液 0.5mL 溶解，滤过待测。 ELISA 法：取匀质后的样品 1g，加水 4mL，1mol/L 盐酸 0.5mL， 10mmol/L2- 硝基苯甲醛溶液。 37℃置 16h， 加 0.1mol/ L 磷酸氢二钾溶液 5mL，加 1mol/L 氢氧化钠 0.4mL 和乙酸乙 酯 5mL，涡旋 30s，离心后取上清液，60℃下氮气吹干，加正己 烷 1mL 和稀释液 1mL，涡旋 1min，离心后去下层 50uL，待测。 ELISA 法：微孔板回温，分别加标准品和样品 50uL，所有 微孔加入 25 uLAOZ-HRP，25 uLAOZ 抗体溶液，密封。混 本文对 27 份样品进行检测，将 HPLC-MS 法来作为对照 方式， 对比 ELISA 法的检测结果。 两种检测方法的定性结果相同， 但是 HPLC-MS 有较好的回收率和精密度。ELISA 法由于孵育 温度和时间需要精准控制，在大批量样品处理时，可能会影响 其结果准确度。因此，HPLC-MS 是作为测定鱼肉中硝基呋喃 的确证、定量的最可靠方法。 虽然 ELISA 法只是半定量检测方法，但由于其检测限低、 易于操作等优势，外加其不受到其他成分干扰，非常适合在批 量普查工作中初筛，这对于实验室快速初筛定性鱼肉中的硝基 呋喃有积极作用。
ELISA 法 方法 HPLC-MS 法
匀孵育 1h 后倒掉溶液重复 3 次加 300 uL 缓冲液，冲洗缓冲液 的步骤， 加 150 uLTMB 底物避光孵育 30min， 加 50 uL 终止液， 放入酶标仪在 λ=450 和 630nm 下读数。 测 定 HPLC-MS 法 液 相 色 谱 条 件： 色 谱 柱 Waters BEH(2.1 mm×50 mm， 1.7μm)；柱温 :30℃。 进样体积：5.0μl； 流速：0.25 ml/min。流动相：0.1% 乙酸水 (A) 和乙腈溶液 (B)， 梯度洗脱：0min，80%；A=8.5min，A=40%；11min，A=10%。 质 谱 条 件： 电 离 方 式 ESI(+)； 毛 细 管 电 压 1.5 KV； 离 子源温度 120℃；锥孔反吹气氮气 100 L/h；去溶剂气氮气温 度 350℃；去溶剂气流量 800 L/h；碰撞气氩气流速 0.25 ml/ min。m/z=236/134 的锥孔电压和碰撞电压为 25V 和 13eV， m/z=236/104 的锥孔电压和碰撞电压为 25V 和 18eV。 结果 27 份样品使用两种方法进行检测后，定性结果相同。 37 份检测结果均为阴性，阳性检出率达到 0%，样品合格率为 100%。方法的回收率和精密度见表一。
表一 AOZ 添加回收率和精密度 0 5.0 测得量 （ug/kg） 0.473 1.065 4.621 0.578 0.812 4.049 回收率 （%） 94.6 106 92.4 116 81.2 8.10 相对标准偏差 （%） 6.7 7.2 7.9 10.6 14.9 17.4
□□马青青 许文清 河南省疾病预防控制中心 铁道警察学院
Jan.-Feb. 2017 China Food Safety
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鱼肉中硝基呋喃的检测分析
DOI:10.16043/ki.cfs.2017.z2.037
硝基呋喃是一种高效抗生素药物，也被非法当做鱼、猪等 动物的生长促进剂使用。研究发现，硝基呋喃具有致癌和致突 变的作用。硝基呋喃类药物的检测方法有 ELISA 法度法、高效 液相色谱法和 HPLC-MS 法。硝基呋喃药物在体内与蛋白结 合生成的代谢物较稳定，因此检测硝基呋喃类药物一般是测定 其代谢物，其中呋喃唑酮的代谢物是 3- 氨基 -2- 噁 唑烷基酮 （AOZ）。本实验以 HPLC-MS 法为对照实验比对 ELISA 法 测定的 27 份市售鱼肉样品，从而验证 ELISA 法在硝基呋喃快 速检测中的有效性、可靠性，为食品监督执法提供参考。 器材 高效液相色谱 - 串联质谱仪（Waters TQ-S）, 酶 标仪（ThermoFisher multiskan）；离心机（Lynx 6000）, 涡 旋振荡器（pro250）, 氮吹仪。 试 剂 硝 基 呋 喃 检 测 试 剂 盒（COKDA0300），AOZ 标 准 溶 液（Sigma-Aldrich 公 司），60% 甲 醇，1mol/L 盐 酸， 50mmol/L2- 硝基苯甲醛二甲基亚砜溶液，0.1mol/L 磷酸氢二 钾溶液，1mol/L 氢氧化钠，20% 甲醇溶液，1mol/L 盐酸，2硝基苯甲醛亚甲基二砜溶液。 实 验 供 试 品 溶 液：HPLC-MS 法： 称 取 2g 样 品， 加 10mL60% 甲醇匀浆 2min，离心后弃去上清液，加 8mL 甲醇洗 涤 1 次，8mL 乙醇洗涤 1 次，8mL 乙醚洗涤 1 次。取标准溶液 AOZ 使其最终浓度 0.5、1、2、4、10ng/mL。每个离心管加 入水 4mL、1mol/L 盐酸 1mL、50mmol/L2- 硝基苯甲醛溶液 0.15mL，混匀。37℃避光 16h。加 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液 5mL，用 1mol/L 氢氧化钠调 PH=7.2~7.4。加乙酸乙酯 5mL， 涡旋 5min。离心后取上清液于 50℃氮气吹干。加 20% 甲醇溶 液 0.5mL 溶解，滤过待测。 ELISA 法：取匀质后的样品 1g，加水 4mL，1mol/L 盐酸 0.5mL， 10mmol/L2- 硝基苯甲醛溶液。 37℃置 16h， 加 0.1mol/ L 磷酸氢二钾溶液 5mL，加 1mol/L 氢氧化钠 0.4mL 和乙酸乙 酯 5mL，涡旋 30s，离心后取上清液，60℃下氮气吹干，加正己 烷 1mL 和稀释液 1mL，涡旋 1min，离心后去下层 50uL，待测。 ELISA 法：微孔板回温，分别加标准品和样品 50uL，所有 微孔加入 25 uLAOZ-HRP，25 uLAOZ 抗体溶液，密封。混 本文对 27 份样品进行检测，将 HPLC-MS 法来作为对照 方式， 对比 ELISA 法的检测结果。 两种检测方法的定性结果相同， 但是 HPLC-MS 有较好的回收率和精密度。ELISA 法由于孵育 温度和时间需要精准控制，在大批量样品处理时，可能会影响 其结果准确度。因此，HPLC-MS 是作为测定鱼肉中硝基呋喃 的确证、定量的最可靠方法。 虽然 ELISA 法只是半定量检测方法，但由于其检测限低、 易于操作等优势，外加其不受到其他成分干扰，非常适合在批 量普查工作中初筛，这对于实验室快速初筛定性鱼肉中的硝基 呋喃有积极作用。
ELISA 法 方法 HPLC-MS 法
匀孵育 1h 后倒掉溶液重复 3 次加 300 uL 缓冲液，冲洗缓冲液 的步骤， 加 150 uLTMB 底物避光孵育 30min， 加 50 uL 终止液， 放入酶标仪在 λ=450 和 630nm 下读数。 测 定 HPLC-MS 法 液 相 色 谱 条 件： 色 谱 柱 Waters BEH(2.1 mm×50 mm， 1.7μm)；柱温 :30℃。 进样体积：5.0μl； 流速：0.25 ml/min。流动相：0.1% 乙酸水 (A) 和乙腈溶液 (B)， 梯度洗脱：0min，80%；A=8.5min，A=40%；11min，A=10%。 质 谱 条 件： 电 离 方 式 ESI(+)； 毛 细 管 电 压 1.5 KV； 离 子源温度 120℃；锥孔反吹气氮气 100 L/h；去溶剂气氮气温 度 350℃；去溶剂气流量 800 L/h；碰撞气氩气流速 0.25 ml/ min。m/z=236/134 的锥孔电压和碰撞电压为 25V 和 13eV， m/z=236/104 的锥孔电压和碰撞电压为 25V 和 18eV。 结果 27 份样品使用两种方法进行检测后，定性结果相同。 37 份检测结果均为阴性，阳性检出率达到 0%，样品合格率为 100%。方法的回收率和精密度见表一。
表一 AOZ 添加回收率和精密度 0 5.0 测得量 （ug/kg） 0.473 1.065 4.621 0.578 0.812 4.049 回收率 （%） 94.6 106 92.4 116 81.2 8.10 相对标准偏差 （%） 6.7 7.2 7.9 10.6 14.9 17.4
□□马青青 许文清 河南省疾病预防控制中心 铁道警察学院
Jan.-Feb. 2017 China Food Safety
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