农药学原理课件--作用机制研究的思路和方法

③天然产物杀虫剂的作用往往比化学合成杀虫剂的作 用更复杂,而且作用缓慢。因此,在观察症状时不但要 观察试虫的急性中毒、死亡等症状,而且要较长时间 地观察其对行为的影响,观察其对生长发育的影响。
研究实例：苦皮藤素Ⅳ
①菜青虫或粘虫幼虫取食少量染有苦皮藤素Ⅳ的叶 片后,一般不再取食,有些试虫不断爬动,但大多数 试虫静止不动。经过一段时间后,所有试虫都静止, 但若用镊子触及幼虫腹部末端,试虫还会爬行。
制作电镜标本
①将试虫快速杀死、解剖。以缓冲溶液冲洗后取出所需组织, 切下材料块,体积应小于1mm3。
②将材料投入4%戊二醛中,在低温条件下作前固定处理。 ③取出材料,以缓冲溶液冲洗后用1%锇酸进行后固定处理。 ④取出材料,用缓冲溶液冲洗后经系列丙酮脱水,通常从
50%→70%→80%→90%→100%。 ⑤脱水后以包埋剂,最常用的是环氧树脂(如Epon812)浸透包
③像Bt的δ 一内毒素那样直接作用于细胞膜上的受体,破坏了 膜的结构,引起失水。
2 组织学观察
昆虫组织学是研究昆虫组织的细胞结构、组成 和功能的科学。昆虫的组织是由细胞和非细胞 结构所构成的,而若干组织又按各种形式组成器 官。执行某些共同机能的器官彼此组合在一起, 形成器官系统,如神经系统、消化系统等等。
肌肉毒剂
以尼亚那的杀虫有效成分ryanoid为代 表, 中毒症状： 不出现兴奋和抽搐,而是全身麻痹,肌肉 松弛,对外界刺激无反应； 但在临近死亡时,肌肉又表现为强直性收
症状学观察应注意的问题
①不同的昆虫可能对同一种药剂有不同的症状表现， 应选择几种有代表性的不同的试虫进行症状学观察。
②同一药剂因剂量不同而对同一昆虫反应出来的症状 也不相同。如溴氰菊酯,在很低的剂量水平下,并无毒 杀、击倒作用,而只表现拒食作用。因此,在观察症状 时,应设置高、中、低几个剂量水平。
进入血淋巴中,但试虫却不表现任何中毒症状。
推测其作用机制：是一个典型作用于昆虫消化系统的胃毒剂
①苦皮藤素Ⅴ抑制或激活了中肠某些酶系,干扰了昆虫的正常 代谢和生理功能。
②像霍乱毒素那样,活性亚基穿过肠细胞进入胞内,激活位于细 胞膜内表面的腺苷酸环化酶,使环磷酸腺苷(cAMP)含量增加, 刺激肠粘膜产生失水效应。
取食苦皮藤素V后，抽搐期柱状细胞顶膜微绒毛虽无明显变化(图2)， 但细胞器已开始瓦解密度降低(图2)； 线粒体肿胀，出现空白亮区(图6)； 内质网小池扩张，粗面内质网减少(图5)。 杯状细胞杯腔面微绒毛减少(图8)。 失水期，细胞及细胞器进一步瓦解(图3)，柱状细胞微绒毛数量减少、零乱(图3)，
Example:天然除虫菊酯
Klinger描述的鳞翅目幼虫的中毒症状:
①背部隆起,迅速不停地爬动,头部左右摆动,口器咀嚼而不 断地有食物吐出;
②全身扭曲,翻滚,头尾收缩又伸直; ③虫体侧卧静止,偶有微弱的抽搐,对外界刺激反应减少; ④完全麻痹,但仍有心跳; ⑤完全死亡。
拟除虫菊酯杀虫剂,其对昆虫的中毒症状也是如此,只不 过作用更加迅速。
至失水末期几乎消失(图4)； 线粒体被严重破坏，外室水肿，嵴紊乱、模糊不清，双层膜亦不清晰(图7)。 内质网池扩张，囊泡化，粗面内质网大量减少(图6)。杯状细胞杯腔变大，微绒毛
进一步减少(图9)。 苦皮藤素V对细胞核、溶酶体及肌细胞无明显影响。
3 生理生化研究
结合症状学和组织学观察的结果,我 们可以粗略推测样品作用于昆虫的哪个 系统,如神经系统,呼吸系统,消化系统, 或体壁结构。在此基础上,针对某一系统 与药剂毒理学密切相关的一些昆虫生理 生化问题进行深入的研究。
几丁糖的重量=干燥至恒重的重量-称量瓶重量-滤纸重量
幼虫
可将3～5头一组以蒸馏水冲洗体表,剪去头、尾和足,再 沿腹中线剪开,除去附着于体壁的肌肉和脂肪体,以蒸馏 水冲洗干净,再经95%、100%乙醇脱水,干燥。称取这种 干燥体壁约300mg,放入消化试管,加入8ml饱和的KOH溶 液,在甘油浴中加热到160℃,保持15～20min。将消化后 的试管内容物小心地倒在滤纸上,以缓慢流动的流水冲洗, 然后以95%、100%乙醇脱水,烘干,称重。
体壁几丁质的相对含量(%)=消化后的体壁重/消化前的 体壁重×1.26×100
式中,1.26为转换系数=乙酰基葡糖的分子量/胺基葡糖 的分子量。
3.1.2
新蜕皮的昆虫表皮,质地柔软,经数小时后表皮变硬,这 个过程称为表皮鞣化或骨化、硬化。这个过程往往总 是伴随着表皮颜色加深,由乳白色逐步变为褐色或黑色, 这个过程称为表皮的黑化或暗化。
溴氰菊酯的中毒症状可划分为两个阶段,即兴奋期和抑 制期。在兴奋期内,试虫乱爬乱动;到抑制期,活动逐渐减少 直至麻痹。10多分钟后,试虫可能死亡亦可能复苏。
呼吸毒剂
以鱼藤酮为代表,中毒症状主要是一个逐渐 麻痹的过程,但对某些昆虫,可能先有一个兴奋过 程,然后进入麻痹状态。
Tischler对鱼藤酮中毒的家蚕幼虫的症状 作了如下的描述: ①不活动,无明显反应(约35min); ②短暂的兴奋期,频繁爬动(约10min); ③运动失调、跌倒、侧卧(约5min);逐渐麻痹。
翔,但结果是不能飞而运动失调; ④痉挛期—仰卧或侧卧,肢体及口器抽搐,腹部伸长; ⑤麻痹期; ⑥昏迷期; ⑦死亡。
Example:有机磷杀虫剂TEPP
Chadnick等以TEPP处理美洲蜚蠊: 先引起兴奋,试虫运动不停; 接着全身开始抽搐,足、翅及腹部颤抖; 然后进入麻痹状态,逐渐死亡
组织学的观察就是进行细胞学观察和器官组织 学观察,其目的在于了解药剂对病变器官细胞的 作用,包括对细胞膜(质膜)、细胞核及细胞质中 各种细胞器,如线粒体、内质网、溶酶体等的观 察,目的在于了解药剂的作用部位。
组织学观察的方法
光学显微镜观察
光学显微镜的最大分辨 能力约为0.2μ m,在这种 分辨能力的显微镜下可 以观察细胞内的结构,如 线粒体、中心体、核仁 等细胞内的显微结构。
如果蜕出的新表皮不及时地鞣化和暗化,昆虫表皮就极 易破裂,昆虫将会死亡。
酪氨酸是昆虫表皮鞣化和暗化过程中起主要作用的氨 基酸。
昆虫中酪氨酸有多种代谢途径,其中之一是酪氨酸→多 巴→多巴胺→N-乙酰多巴胺,而N-乙酰多巴胺是昆虫表 皮鞣化剂。
方法
A 游离酪氨酸测定 在幼虫接近蜕皮或化蛹时,可测定血淋巴
②一般在食毒后2h左右试虫失水,。这一阶段历时 40～160min。
③若试虫摄毒较多,失水多,则全部虫体呈水渍状,虫体极度 缩短,体色不变,慢慢死亡;若摄毒较少,试虫失水不多,则可 恢复。
另外 将苦皮藤素Ⅴ施于试虫体表,经HPLC检测,苦皮藤素Ⅴ可
神经毒剂 Example: DDT
按Tobias的描述,美洲蜚蠊中毒后典型症状表现为:
①足过度地伸张,身体重心抬高,站立不稳; ②足及头部震颤; ③步态失调,对外界刺激过度敏感; ④腹部朝天仰卧,又努力翻身,多次重复进行; ⑤足痉挛,包括两类动作,一是高频颤抖,二是大动作的屈、伸; ⑥停止颤抖,只表现为跗节、触须、触角的孤立抽搐; ⑦除心跳外,完全静止不动直至真正死亡。
②冲洗、脱水。固定一定时间后将材料取出用水将组织中的固定液彻底冲洗干 净。然后再脱去组织中的水分。最常用的脱水剂是乙醇。通常从 30%→50%→70%→80%→90%→100%逐级脱水。
③透明、透蜡。脱水后的材料中含有脱水剂,不能与石蜡混溶,只能与透明剂混 溶。因此,脱水后应用透明剂(最常用的是二甲苯),以取代材料中的脱水剂。然 后再以石蜡取代材料中的透明剂。
3.1
3.1.1 体壁几丁质含量的测定
几丁质是高分子的含氮多聚糖,由乙酰胺基 葡萄糖聚合而成,用以支撑体壁系统,一般占表皮 干重的20%～50%。
测定体壁几丁质含量,就可以知道药物是否 直接或间接地影响了昆虫表皮中几丁质的沉积。
如果处理组试虫表皮几丁质含量显著降低, 则进一步研究其作用机制,如测定几丁质酶、几 丁质合成酶等活性的变化。
②进入麻醉状态。触及腹部末端,试虫不再爬行,虫 体瘫软,但反应并未完全消失,菜青虫个别试虫的 头部还可微微扭动,但粘虫幼虫进入麻醉状态则对 外界的刺激反应消失。
③有些试虫如果摄入毒物剂量小,则麻醉一段时间 后试虫会苏醒,并可继续取食。
另外 ①苦皮藤素Ⅳ即使和微量的化学合成神经毒剂混用,试虫就不
再表现上述这种麻醉作用。 ②麻醉作用的选择性很强,即只对一部分鳞翅目幼虫起麻醉作
作用机制研究的思路和方法
1. 杀虫剂作用机制研究的思路和方法
1.1 症状学观察
杀虫剂症状学(Symptomatology)是研究杀虫剂对 靶标昆虫引起的中毒症状的科学。
从中毒症状可以推测其毒理作用,因此,症状学观 察是研究杀虫剂作用机制最初的,然而也是最重 要的一步。
必须指出的是同一杀虫剂对不同种类的昆虫乃至 同种昆虫的不同虫态引起的症状可能不同。 杀虫剂的作用机制乃是决定其症状的主要因 素。在某种程度上,我们可以通过观察其中毒症 状粗略地了解作用机制。
用。
推测其作用机制
一是物理的吸附作用。 二是可能是影响以谷氨酸为介质的神经—肌肉接头的兴奋传导。 三可能是一种肌肉毒剂,影响肌肉收缩。究竟作用机制如何,尚
有待进一步研究。
研究实例：苦皮藤素V
①试虫连续或间断取食一定量的染毒叶片后,一般不再继续 取食。经过一段时间,试虫表现明显的兴奋症状,在培养 皿内不断爬动,甚至翻滚;试虫虫体侧卧,前后弓缩,扭曲, 抽搐。这段时间可持续20～60min。
测定昆虫表皮几丁质含量最简单的方法
重量法
Mayer
(Stomoxys calcitrans)蛹几丁质的方法:
将5头蛹放入试管,用玻棒捣碎。加入2ml 50%的KOH(W/W), 在105℃条件下加热1h，KOH消化液经过干燥的、预先称 重的25mm直径玻璃纤维滤纸过滤。滤渣在过滤器中先用 100ml蒸馏水洗,然后用100ml 95%的乙醇洗,再用100ml蒸 馏水洗。滤纸转入一称重的称量瓶内,100℃条件下干燥 至恒重。这样测得的是几丁糖的量。
④包埋。将透蜡后的材料浸入熔化了的石蜡中。石蜡冷固后就将材料包埋其中, 便于切片和保存。
⑤切片、贴片。将被包埋的材料连同包埋块用切片机切片(厚度5～7μm),并用 明胶粘片剂将切片平整地粘在玻片上,干燥。
⑥染色。切片必须经染色才能清楚地显示细胞结构,便于观察。根据所用的固 定液和显色的需要,选用合适的染料(如苏木精—伊红)染色。石蜡切片经染色 后就可进行显微观察。
核心的技术是制作高质 量的石蜡切片。
电子显微镜观察
指透射电镜,主要用于观察 各细胞器的细微结构病变。
电镜的基本结构和光学显 微镜差不多,所不同的是以 电子束代替了照明光线,以 特殊的电极或磁极代替了 光学显微镜的聚光镜、物 镜和目镜的作用。
核心技术是制作电镜标本。
石蜡切片制作
①取材、固定。将试虫迅速杀死,解剖后取出所要观察的组织,浸入固定液(如 用波因氏或卡诺氏固定液),使细胞形态、结构尽可能保持活体时的状态。
有些昆虫自断式掉下的足(即自行离体的足)仍可继续进 行特有颤抖。
Example: BHC
六六六和DDT症状大致相同,但作用更加迅速。 按Pasguier(1947)的描述,沙漠蝗中毒后的症状为:
①先兆期—往往有腹部抬高的运动; ②兴奋前期—腹部收缩运动,并用后足摩擦; ③过度兴奋及运动失调期—对外界的刺激过度敏感,企图飞
埋,在35℃,45℃,60℃各聚合1天。 ⑥超薄切片机切片,厚度大约500～600nm。 ⑦以醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。
苦皮藤素Ⅴ对昆虫中肠细胞
+
对照组
处理组
对照组粘虫中肠柱状细胞顶膜微绒毛排列整齐有序(图1)， 线粒体双层膜完整，内嵴清晰可见(图5)， 细胞质密度高．细胞器排列有序(图1)， 粗面内质网排列整齐，表面附着大量的核糖体(图4)， 杯状细胞杯腔面突起呈排列整齐的微绒毛(图7)。