天然药化实验

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实验一 黄柏中盐酸小檗碱的提取分离与鉴定（10学时）
【目的要求】
1. 掌握黄柏中提取盐酸小檗碱的原理和方法。

2. 熟悉盐酸小檗碱的化学性质和鉴定方法。

3. 掌握渗漉法、盐析法、结晶法的基本操作方法。

【实验原理】
黄柏为芸香科(Rutaceae)植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid ）及黄柏树(Phellodendron amurense Rupr.)的干燥树皮。

树皮中含有小檗碱(Berberine)、木兰花碱(Magnoflorine)、黄柏碱(Phellodendrine)等多种生物碱及内酯、甾醇等，其中以小檗碱为主要药效成分(中华人民共和国药典，2000)，含量为1.4%-5%(川黄柏含量较高)。

其性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解表、退虚热之功效。

1.小檗碱(berberine)异名黄连素，分子式[C 20H 18NO 4]+，分子量336.37，黄色针状结晶。

作为临床上一种常用的广谱抗菌药，小檗碱主要用于菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染。

现代研究证明小檗碱有抗肿瘤、抗心率失常、降压、降血糖等作用，在临床上有越来越广泛的应用，需求量日益增加。

2.溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。

3.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。

利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，先将药材用石灰水润湿，使药材吸水膨胀，小檗碱游离，同时可使黄柏中含有的粘液质沉淀。

用水渗漉法提取小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出，结合盐析法得到盐酸小檗碱。

【实验步骤】
1.提取 称取黄柏粗粉100g 置大蒸发皿中，加入适量石灰乳搅拌均匀，放置溶胀20min ，加入6倍量的饱和石灰水（或1%Ca(OH)2溶液）浸泡30min 后装入渗漉筒内，以5～6mL/min 速度渗漉。

收集渗漉液500～600mL 即可停止渗漉。

2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12，静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量6%-8% NaCl ，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。

3.精制将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI 调pH 2左右，放置1-2小时，滤取结晶，纯化水洗至pH 4，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。

4.盐酸小檗碱的鉴别
（1）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL溶解后，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。

（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。

（3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。

溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。

【基本操作注意事项】
1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。

2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。

其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。

3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。

【思考题】
1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？
2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。

3. 试析生物碱的分离方法
实验二槐花米中芸香甙的提取、精制和检识（12学时）
一、槐米中芦丁的提取
槐米系豆科槐属植物（Sophora japonica L．）的未开放花蕾。

味苦性凉、具清热凉血、止血之功。

常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。

槐米常炒炭应用。

槐米的主要化学成分为芦丁，亦称芸香苷，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。

芦丁广泛存在于植物界，已发现的含芦丁植物至少在70种以上，其中以槐花米和荞麦叶（含量约8%）含量较高，可作为提取芦丁的原料。

药理实验证明芦丁具有减少毛细血管的通透性作用，临床上主要用为防治高血压病的辅助治疗药物。

芦丁可降低毛细血管脆性和调节通透性。

临床上用作毛细血管脆性引起的出血症。

此外，芦丁对于放射线伤害所引起的出血症亦有一定作用。

[目的要求]
1、通过芦丁的提取与精制掌握碱－酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

2、得到芦丁粗品。

[实验原理]
芦丁（rutin ）：C 27H 30O 16·3H 2O ，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。

难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。

槲皮素（quercetin ）：C 15H 10O 7·2H 2O ，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。

能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。

芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。

利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。

芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。

芦丁的结构如下：
[仪器与试剂]
仪器：电炉、研钵、石棉网
玻璃仪器：抽滤瓶、布氏漏斗、玻璃棒、1000ml 烧杯、500ml 烧杯、漏斗 试剂：槐花米、饱和石灰水溶液、盐酸、pH 试纸 其他：滤纸
[实验内容]
于1000ml 烧杯中加入500ml 饱和石灰水，煮沸2~3min 后，称取50g 槐花米（粗粉），加热微沸30min ，注意添加水保持原体积并维持pH8~9，趁热用脱脂棉过滤，滤渣再加入300ml 饱和石灰水，维持pH8~9，煮沸10min ，趁热用脱脂棉过滤，合并滤液，稍冷（60~70℃），用浓HCl 调至4~5，放置1h 使沉淀完全，抽滤，用水洗3~4次，置80℃烘箱低温干燥得淡黄色粗制芦丁，称重，计算产率。

注意事项：
（1）开始用沸水提取。

（2）提取液要趁热过滤。

（3）提取时要不断补充水分。

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500ml 饱和石灰水，加热，并维持pH8～9
滤液 药渣
10分钟，维持pH8～9
×） pH 至4 ～5 次
沉淀
低温（80℃）干燥
粗品
注意：加入饱和石灰水溶液既可以达到碱溶解提取芦丁的目的，又可以除去槐花米中大量多糖粘液质。

也可直接加入150mL 水 和5gCa(OH)2粉末，而不必配成饱和溶液。

[思考题]
1、提取液为什么要趁热过滤？ 二、芦丁的精制和酸水解
[目的要求]
1、芦丁粗品重结晶，得到芦丁精品；
2、芦丁酸水解，得到苷元槲皮素精品及糖水解液。

[实验原理]
1、芦丁可溶于热水，难溶于冷水。

其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱中易溶解，而在酸性条件下易析出沉淀。

故可采用碱提酸沉法提纯芦丁。

2、利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖。

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[实验内容]
1、将芦丁粗品置500ml烧杯中，加适量（按芦丁：水＝1g：200ml）蒸馏水，于石棉网上加热溶解，趁热抽滤。

滤液静置30min，即析出沉淀。

抽滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀2~3次，抽干，于70~80℃干燥1小时，即得精制芦丁。

称重，计算产率，测mp（文献值为174~178℃）。

2、取芦丁粗品1g，研细，置于250ml圆底烧瓶中，加2%H2SO4溶液200ml，于直火上加热回流30min，析出的黄色沉淀为槲皮素，放冷，静置，抽滤，滤液保留作糖部分的鉴定。

沉淀经水洗后再用95％乙醇重结晶1次，得黄色针状结晶，于70~80℃以下干燥，即得精制槲皮素。

计算收率。

芦丁粗品
水（1：200）加热溶解
趁热抽滤
滤液
静置，抽滤，干燥，计算收率
芦丁精制品
称取芦丁粗品1g
置250ml烧瓶中
加2%H2SO4200ml
加热回流30min
放冷，静置，抽滤
沉淀
水洗两次，干燥
95％乙醇重结晶
称重，计算收率
黄色细针状结晶（槲皮素）
三、芦丁、槲皮素的鉴定
一、实验目的
1、学习黄酮类化合物的颜色反应
2、黄酮苷及苷元的硅胶层析方法
二、实验原理
1、HCl-Mg反应：盐酸镁粉反应是检查中药中是否有黄酮类化合物的最常用方法之一。

在样品的乙醇或甲醇溶液中加入少许镁粉振摇，再满加几滴浓盐酸，l－2分钟（必要时水浴上加热）即显出颜色。

黄酮、黄酮醇类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类化合物一般显红色到紫红色，个别显蓝或绿色（如7，
3’，4’一三羟基二氢黄酮）。

分子中特别是在B环上有-OH或-OCH3。

取代时颜色随之加深。

2、Molish反应：黄酮的糖苷首先在浓硫酸作用下水解成相应的苷元和单糖，然后发生了单糖的脱水和颜色反应。

单糖在浓无机酸的作用下脱水生成糠醛或糠醛的衍生物。

戊糖变成糠醛，己糖相应地生成5-羟甲基糠醛。

Molish反应用浓硫酸作脱水剂，再与二分子α-萘酚缩合成醌型化合物而显紫色，反应如下：
3、AlCl3：络合反应。

凡3位或5位有羟基的黄酮会因与Al产生络合物而显鲜黄色。

三、实验方法
1、取精制后的芦丁和槲皮素各10mg，分别与5ml乙醇配制成样品溶液，备用。

2、HCl-Mg反应：取样品溶液各1ml，加少许镁粉，加2滴浓HCl，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色，观察颜色变化，比较芦丁和槲皮素的不同。

3、Molish反应：
各取溶液1ml，加5%α-萘酚（乙醇溶液）试剂1~2滴，摇匀。

倾斜试管，沿管壁徐徐注入浓硫酸约1 ml静置。

观察两层溶液的界面变化，出现紫色环者为阳性，表示样品分子中含有糖的结构（糖和苷类均呈阳性反应），比较芦丁和槲皮素的不同。

4、1%AlCl3（乙醇溶液）：取样品溶液各1ml，加入1ml 1%AlCl3，观察颜色变化，比较芦丁和槲皮素的不同。

实验三大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定（12学时）
一、目的和要求
1、了解从大黄中提取游离蒽醌类化合物的提取分离的基本原理和方法。

2、掌握pH 梯度法的原理及操作技术。

3．学习蒽醌类化合物鉴定方法。

二、原理
大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。

自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。

大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L ），大黄（R. officinale Baill ）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll ）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。

已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：
O
OH
2
OH
R 1
R 1 R 2 名 称
晶 形 熔 点 -H
-COOH 大黄酸(Rhein)
黄色针晶 318~320℃ -CH 3 -OH 大黄素(Emodin)
橙色针晶 256~257℃ -H
-CH 2OH 芦
荟
大
黄
素(Aloe-emodin)
橙色细针晶
206~208℃
-CH 3 - OCH 3 大黄素甲醚(Physcion) 砖红色针晶
207℃
-H
-CH 3
大黄酚(Chyrsophanol) 金色片状结晶
196℃
大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。

大黄酸连有-COOH ，酸性最强；大黄素连有β-OH ，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH ，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH 3和-CH 3，后者只连有-CH 3，因而后者酸性排在第四位。

三、实验步骤
1．大黄总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉50 g ，加20％硫酸溶液150 ml 润湿，再加氯仿200 ml ，回流提取2 h ，稍冷后过滤，残渣弃去，氯仿提取液于分液漏斗中，分出酸水层，得氯仿提取液。

注意：①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌苷的形式存在于植物组织中。

所以要用酸水解使其生成苷元。

蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。

氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试
验用。

2．蒽醌类成分的分离与精制
(1) 大黄酸的分离与精制
将含有总游离蒽醌的氯仿液225ml移至500ml的大分液漏斗中，加5%碳酸氢钠溶液振荡提取，水层呈紫红色。

分出水层，再重复提取数次（消耗碳酸氢钠溶液总体积约140ml），直至不显红色为止。

合并水层，用盐酸酸化至pH3左右，即得黄色沉淀。

过滤，用水洗沉淀数次，再以少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。

干燥，干燥后的样品加冰醋酸5ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。

(2)大黄素的分离与精制
将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用5%碳酸钠溶液振荡提取数次（消耗碳酸钠溶液总体积约140ml），水层呈红色，合并水层，加盐酸至pH=3，得黄色沉淀，过滤，用水洗沉淀，再以少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。

沉淀经干燥后，用5ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。

(3)芦荟大黄素的分离和精制
余下氯仿液移至分液漏斗后，用0.25%氢氧化钠溶液振荡提取数次(消耗氢氧化钠溶液总体积约270ml)，水层呈红色，合并水层，加盐酸至酸性，得橙色沉淀，过滤，用水洗沉淀，干燥，用5ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。

(4)大黄酚和大黄素甲醚的分离和精制
将上述0.25%氢氧化钠溶液提取后的氯仿层以5%氢氧化钠溶液振荡提取数次至无色。

水层呈深红色，合并水层，加盐酸至酸性，得黄色沉淀，过滤，水洗沉淀，干燥后得大黄酚和大黄素甲醚混合物。

3.蒽醌类成分的鉴定
(1)蒽醌类成分化学鉴定
a. Brontrager’s反应
分别取各蒽醌结晶数毫克置于小试管中，加2％氢氧化钠溶液l ml，观察颜色变化。

凡有互成邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。

b.醋酸镁反应
分别取蒽醌结晶数毫克，置于小试管中，各加乙醇l ml使溶解，滴加0.5％醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化。

（2）色谱鉴识
薄层板：硅胶G板
点样：提取的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的混合物
展开剂：石油醚－乙酸乙酯－甲酸（15：5：1）
展开方式：上行展开
显色：可见光观察，下观察，记录黄色斑点出现的位置。

观察记录：记录图谱并计算Rf值。

思考题：
1.大黄中5种羟基蒽醌的酸性和极性大小应如何排列？为什么？
2.pH梯度法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？。