石菖蒲挥发油微乳对脂多糖诱导大鼠原代神经胶质细胞炎性反应的抑制作用及其机制

石菖蒲挥发油微乳对脂多糖诱导大鼠原代神经胶质细胞炎性反
应的抑制作用及其机制
王光明;李绍林;蔡琳;颜仁梁;赵珍东;夏黎
【摘要】目的:研究石菖蒲对脂多糖(LPS)诱导的大鼠原代神经胶质细胞炎性反应的抑制作用,探索其对神经系统保护作用的可能机制.方法:分离提取大鼠原代神经胶质细胞,用LPS刺激2h后分别加入不同浓度的石菖蒲挥发油微乳含药血清,采用硝酸还原酶法(Griess法)检测石菖蒲对一氧化氮的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平,通过实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)测定细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide
synthase,iNOS)mRNA表达.结果:脂多糖(LPS)能够激活神经胶质细胞,不同浓度的石菖蒲含药血清在不影响细胞存活率的情况下,可以显著降低细胞培养上清液中NO、IL-1β、IL-8、TNF-α水平,细胞内iNOS mRNA表达也明显减少(P<0.05).结论:石菖蒲对神经系统的保护机制可能与抑制胶质细胞炎症有关.
【期刊名称】《江西中医药》
【年(卷),期】2017(048)010
【总页数】4页(P65-67,74)
【关键词】石菖蒲;含药血清;神经胶质细胞;脂多糖
【作者】王光明;李绍林;蔡琳;颜仁梁;赵珍东;夏黎
【作者单位】广东食品药品职业学院广州 510520;广东食品药品职业学院广州510520;广东食品药品职业学院广州 510520;广东食品药品职业学院广州
510520;广东食品药品职业学院广州 510520;广东食品药品职业学院广州510520
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
石菖蒲是天南星菖蒲属多年生草本植物（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根茎，其味辛、苦、温，归心、胃经，具有开窍豁痰、化湿开胃、醒神益智之功效［1］。

药理实验结果显示，石菖蒲对中枢神经系统有抗抑郁、抗惊厥、抗老年痴呆及催眠镇静等多种药理作用［2］。

神经胶质细胞广泛分布于中枢和周围神经系统，不仅能进行营养输送、物质代谢、还具有稳定内环境，参与神经系统的发育和修复再生、参与免疫应答等作用。

最新研究结果显示，神经胶质细胞对正常的脑发育、中枢再生和神经元调控等方面的作用，已不亚于神经元本身［3］。

本研究以石菖蒲挥发油微乳（菖油微乳）含药血清为研究对象，观察其对LPS诱导大鼠原
代神经胶质细胞急性炎性反应的影响，并对其神经系统保护作用机制进行初步探讨，为石菖蒲的临床应用提供一定的实验依据。

1.1 实验材料动物：清洁级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，广东省实验动
物中心提供，实验动物质量许可证号：2015A012；出生1～2d雄性SD大鼠，广东省实验动物中心提供，实验动物质量许可证号：2005A016，实验动物环境设施合格证号：SYXK（粤）2008-0094。

实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司）；高温低速离心机（Sigma
公司）；LPS（Sigma公司）；高糖培养基（DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA和青链霉素（Hyclone公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）、RevertAid First Strand cDNA Sunthesis Kit（Thermo Scientific公司）；Universal SYBR Green Supermix 2×Utag PCR Master（BIORAD公司）；
TNF-α、IL-1β、IL-8酶联免疫吸附试剂盒（R＆D公司）；其他试剂均为分析纯。

石菖蒲饮片购自康美药业股份有限公司（批号：15082701），经广州中医药大学第二临床医学院陈燕芬主任中药师鉴定为天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根茎，符合《中国药典》2015年版中关于石菖蒲药
材的要求。

1.2 方法
1.2.1 菖油微乳含药血清的制备石菖蒲饮片粉碎过40目筛，经超临界CO2萃取（萃取压力22.5MPa，萃取温度43℃，解析压力4.0MPa，解析温度25℃，萃
取时间126min），从萃取釜收集挥发油，备用。

取超临界萃取所得挥发油与油酸乙酯按1∶1混合均匀作为微乳油相，加入8倍量混合表面活性剂（Cremophor EL 与异丙醇之比为1∶1），充分搅拌均匀后，往混合相中缓慢加入5倍量水相，边加水边匀速搅拌至清澈状，即得石菖蒲挥发油微乳（每克微乳样品含生药
1.67g），密封，4℃保存，备用。

参考文献确定给药剂量：给药剂量=临床常用剂量×动物等效剂量系数c（按体表面积）。

得出石菖蒲挥发油微乳（菖油微乳）高、中、低剂量组给药剂量分别为0.5、1.5、4.5g/kg（根据大鼠与人体表面积换算，分别相当于成人每日用量的1/3倍、1倍和3倍），选择成年SD大鼠80只，随机分为4组，每组20只，分别灌胃生理盐水（空白对照组）、菖油微乳高、中、低剂量组按0.5、1.5、4.5g/kg剂量灌胃，分早晚2次灌胃，连续灌胃7d，于最后1次给药后1h行心脏采血，静置2h，3000r/min离心15min，吸取血清，用0.22μm滤膜过滤除菌，56℃水浴30min灭活，-20℃冰箱保存备用，各组血清
均在制备后1个月内使用，使用时以10%胎牛血清稀释为所需浓度。

1.2.2 大鼠原代神经胶质细胞培养参照文献方法，将乳鼠颈椎脱臼处死后，在无菌条件下取完整鼠脑部，解剖镜下剥离脑膜和血管等纤维成分，0.25%胰蛋白酶消化过滤，离心5min（1500r/min），无菌微孔滤膜（0.22μm）过滤后10%胎牛血
清培养。

将其接种于25cm2的塑料培养瓶中，密度为每瓶2×107个细胞，放置
于饱和湿度的二氧化碳培养箱（5%CO2、37℃）中静置原代培养。

48h 后换液，7～10d 长满备用［4］。

1.2.3 实验分组与给药将大鼠原代神经胶质细胞分为6组，每组6份，1组为空白对照组，2组为LPS（10μg/L）组，3、4、5 组分别为 LPS（10μg/L）+菖油微
乳处理组，菖油微乳处理组的浓度分别设置为低剂量组、中剂量组和高剂量组，实验重复6次。

空白对照组不加药，LPS模型组均加入LPS作用2h，3个给药组培养皿加入菖油微乳作用24h。

1.2.4 MTT实验检测细胞的增殖能力各组细胞以1×105/mL的密度，100μL/孔接种于96孔板。

每孔加20μL MTT（5mg/mL），继续培养4h，小心吸取板中培
养液，每孔加入100μL DMSO ，室温摇床振荡混匀10min，充分溶解紫色结晶后，用酶联免疫仪在波长570nm处读取吸光度（A）。

设定正常对照组MTT存
活率为100%，其余各组的MTT存活率按公式：MTT存活率=（实验孔A均值/
对照孔A均值）×100%计算。

1.2.5 Griess法检测培养上清中一氧化氮参照文献方法［5］，取 100μL 细胞上清，加入50μL Griess A试剂，37℃避光反应10min，加入50μL Griess B试剂，37℃避光反应10min，立即于550 nm处测定吸光度值，通过检测细胞上清中
NO2-含量，用以反应细胞释放一氧化氮（NO）的水平。

1.2.6 Real time PCR检测神经胶质细胞iNOS和GAPDH mRNA表达 Trizol法
提取神经胶质细胞总RNA并采用紫外分光光度计测定纯度及浓度。

按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录合成cDNA，反应条件：37℃孵育15min，85℃ 5s终止反应。

引物序列：iNOS正向引物：5’- CGG CAA ACA TGA CTT CAG GC-3’，反向引物：5’-GCA CAT CAA AGC GGC CAT AG-3’；GAPDH 正向引物：5’-CAC TCA CGG CAA ATT CAA CGG CAC-
3’，反向引物：5’-GAC TCC ACG ACATAC TCA GCA-3’。

PCR反应体系按Universal SYBR Green Su permix 2×Utag PCR Master说明书配制。

反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，57℃退火/延伸30s，45个循环；60～95℃溶解曲线分析60s。

以10倍梯度稀释cDNA获得6个质量浓度梯度的标准品，分别对目的基因和内参基因制作标准曲线。

标准品和待测样品同时进行扩增。

目的基因
Ct值代入目的基因的扩增直线方程，计算出“起始模板浓度”，同理算出内参基
因的“起始模板浓度”。

同一样品的目的基因定量值除以内参基因定量值即该样品相对表达量。

1.2.7 ELISA法检测培养细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-8水平按照ELISA试剂
盒说明书操作，依次加入收集的上清液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、底物及终止液等，进行测定。

1.3 统计学分析计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS l9.0进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验分析。

2.1 神经胶质细胞培养结果本实验是以出生24 h以内的仔鼠作为取材对象，得到了数量较大，质量较高的胶质细胞，然后通过差速贴壁的方法去除其中的神经元细胞和成纤维细胞，得神经胶质细胞（含星形胶质细胞、小胶质细胞）。

2.2 不同剂量菖油微乳对LPS作用下神经胶质细胞存活率的影响结果见表1，与
空白对照组相比，LPS组神经胶质细胞存活率下降了66.9%（P＜0.01），与LPS 组相比三剂量的菖油微乳含药血清不同程度地提高了损伤神经胶质细胞的存活率，且浓度越高，作用越明显。

2.3 Real time PCR检测神经胶质细胞iNOS mRNA转录结果显示，与空白对照
组相比，LPS组的iNOS mRNA水平明显升高（P＜0.01），而不同浓度的菖油微乳含药血清能够明显抑制iNOS mRNA的转录，且存在一定的量效关系，见表2。

2.4 不同剂量菖油微乳对胶质细胞分泌NO、TNF-α、IL-1β、IL-8的影响上清液
中炎症因子含量检测结果显示：LPS显著刺激星形胶质细胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-8大量释放。

与LPS组比较，不同浓度的菖油微乳含药血清均能明显降低这些炎性因子的含量，且这一抑制作用与菖油微乳浓度成正相关，见表3。

神经胶质细胞构成大脑微环境，对维持神经内环境稳定，神经系统正常生理功能的发挥及病理损伤过程至关重要。

但在大脑开始衰老后，它逐渐转化为影响神经细胞健康的不安定因素，神经胶质细胞异常活化，释放多种炎症因子，在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病等慢性神经退行性疾病中作为主导因素之一［6］。

长期的临床实践证明中药治疗神经退行性疾病具有独特疗效，其作用机制与抑制神经炎症有关［7-8］。

石菖蒲作为临床常用中药，被广泛应用于治疗老年性痴呆、健忘、癫痫等脑科疑难病症，是难得的脑科良药。

石菖蒲及其活性成分细辛醚能够促进在体神经干细胞增殖和神经发生，其机制与调控ERK蛋白激酶的级联反应直接促进神经干细胞增殖和神经发生有关［9］。

诱导型一氧化氮合酶（i NOS）催化产生一氧化氮（NO）是引起 AD 的主要发病机制，目前认为 AD患者大脑中的胶质细胞过度表达i NOS 是造成神经元损伤非常重要的原因［10］。

因此，直接抑制 i NOS的表达和 NO的产生，是炎症疾病治疗的有效手段之一。

本实验显示菖油微乳能明显抑制 LPS 诱导的神经胶质细胞 i NOS mRNA的转录，从而抑制需i NOS催化的 NO生成。

这可能是菖油微乳通过抑制小胶质细胞活化，从而抑制神经性炎症的功能之一。

神经胶质细胞（小胶质细胞）长期持续活化，会分泌神经毒性物质和炎性介质，如IL-1β、IL-8、TNF-α、NO 等［11］。

IL-1β、IL-8、TNF-α是神经炎症中主要的促炎症细胞因子，引起胶质细胞活化及神经退行性病变。

TNF-α在外周是一种炎性细胞因子前体，在AD患者血清、脑脊液、脑皮层TNF-α浓度都明显升高［12］。

本文研究结果表明LPS刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α表达量明显上调，
菖油微乳浓度依赖性抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等炎性因子的表达，从而减轻神经胶质细胞损伤，其机制可能是菖油微乳通过 ERK 信号通路发挥对炎性分子的抑制作用，这一作用可能是菖油微乳发挥临床疗效的重要机制之一。

AD是一个复杂多机制的参与过程，菖油微乳的保护作用是否涉及到其他机制，还有待继续研究。

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【相关文献】
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中图分类号：R285.5。