瑞巴派特对实验性结肠炎大鼠肠道黏膜的保护作用

瑞巴派特对实验性结肠炎大鼠肠道黏膜的保护作用
徐进;杨洁;王斌;陈珺;刘颖;刘涵翰
【摘要】目的探讨瑞巴派特对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎的肠道黏膜保护作用及可能的作用机制.方法 40只成年雌性SD大鼠随机分为对照组(G1)、模型组(G2)、瑞巴派特治疗组(G3)、奥沙拉嗪治疗组(G4),每组10只.连续治疗结束后取病变段肠组织,行结肠大体损伤评分;结肠组织匀浆检测白三烯
B4(LTB4)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及还原型谷胱甘肽(GSH-Px)活性;免疫组化法检测结肠组织环氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧合酶(5-LOX)的表达量;酶联免疫吸附法检测血清TNF-α、IL-10含量.结果治疗后,与G2组比较,G3组和G4组的结肠大体损伤评分、血清TNF-α、IL-1O水平、结肠组织LTB4水平均明显降低,而SOD、GSH-Px的活性均明显升高(P＜0.05).与G2组相比,G1、G3、G4组COX-2及5-LOX蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05).G1组COX-2和5-LOX蛋白表达极弱,与G3、G4组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论瑞巴派特对TNBS诱导的大鼠结肠炎有较好的治疗作用,其作用机制可能与上调结肠组织中SOD及GSH-Px的活性、调节细胞因子、降低COX-2及5-LOX的表达有关.
【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》
【年(卷),期】2016(025)007
【总页数】4页(P745-748)
【关键词】溃疡性结肠炎;瑞巴派特;环氧合酶-2;5-脂氧合酶
【作者】徐进;杨洁;王斌;陈珺;刘颖;刘涵翰
【作者单位】湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰442000;湖北医药学院附属人民医院健康管理中心,湖北十堰442000;湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰442000;湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰442000;湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰442000;湖北医药学院附属人民医院病理科,湖北十堰442000
【正文语种】中文
【中图分类】R574.62
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因、发病机制尚未完全明确的结直肠慢性非特异性炎性反应。

病变主要累及黏膜和黏膜下层，促炎与抗炎因子失衡及氧自由基损伤在UC发病过程中起重要作用[1]。

瑞巴派特作为一种消化性溃疡的胃肠黏膜保护剂，已被证明具有抗溃疡、保护胃肠黏膜细胞、增加内源性前列腺素合成、激活一氧化氮系统、清除自由基的作用[2]。

临床上应用瑞巴派特治疗UC 取得一定的临床疗效[3]，但其对肠道黏膜的保护作用机制尚不清楚，本实验研究瑞巴派特在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎模型中的治疗作用，并试图探讨其可能的作用机制。

1.1 实验动物与主要试剂清洁级健康成年雌性未育Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体质量200～220 g，由湖北医药学院动物实验中心提供[许可证号：SCXK(鄂)2011-0008]，置于温度为(22±1)℃，湿度为50%～70%的净化动物饲养房内，混合饲料喂养，禁食不禁水。

5%TNBS水溶液(美国Sigma公司)、瑞巴派特(浙江远力健药业)、奥沙拉嗪(天津力生制药)、白三烯B4(LTB4)酶联免疫吸附测定试剂盒(R&D Systems, Inc.)、还原型谷胱甘肽(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗鼠COX-2多克隆抗体及兔抗鼠5-LOX多克隆抗
体(美国Cayman Chemical公司)。

1.2 实验方法
1.2.1 药物配制：将5% TNBS 20 ml溶于50%乙醇溶液20 ml，制成2.5% TNBS(V/V)溶液；1片瑞巴派特(100 mg)溶于20 ml生理盐水中；1片奥沙拉嗪(250 mg)溶于20 ml生理盐水，制成溶液后备用。

1.2.2 UC模型建立及分组：40只雌性SD大鼠随机分为对照组(G1)、模型组(G2)、瑞巴派特治疗组(G3)、奥沙拉嗪治疗组(G4)，每组10只。

模型建立参照文献[4]，大鼠禁食48 h后，G1组采用25%乙醇溶液灌肠，1.0 ml/只，其他组采用2.5% TNBS(V/V)溶液灌肠，1.0 ml/只。

24 h后，G1、G2组：每天无菌生理盐水灌胃，2.0 ml/只；G3组：每天瑞巴派特溶液灌胃，5 mg/kg；G4组：每天奥沙拉嗪溶液灌胃，125 mg/kg，共进行10 d。

1.2.3 取材：治疗结束后(第11天)，所有大鼠20%乌拉坦腹腔注射(1.5 ml/只)，
麻醉后经腹主动脉无菌取血约2.0 ml，提取血清，-20 ℃保存，用于检测TNF-α、IL-10水平。

从距肛门1.0 cm向结肠近端切取6.0 cm肠段，纵行切开，用无菌生理盐水洗净内容物，行大体损伤评分[5]。

无损伤记0分，充血但无溃疡记1分，
充血且肠壁变厚，但无溃疡记2分，有1处溃疡但无肠壁增厚记3分，有2处或
2处以上溃疡/炎症记4分，有2处或2处以上大溃疡和炎症或有1处溃疡和炎症沿结肠纵轴超过1 cm记5分，沿结肠纵轴损伤超过2 cm以上，每超过1 cm增加1分，记6～10分。

1.2.4 结肠匀浆检测：结肠组织SOD、GSH-Px活性及LTB4含量的检测分别按照试剂盒说明书的要求切取肠段，去除脂肪系膜组织。

加冰生理盐水低温制备10%
匀浆。

-20 ℃贮存待检测。

1.2.5 结肠组织COX-2、5-LOX免疫组化染色分析：取结肠病变部位组织，行免
疫组化染色。

细胞呈棕黄色为阳性，定位于细胞核和(或)细胞质。

阳性细胞比率按
如下方法计算，在染色最强部位随机选取3个视野，计算每只大鼠的平均阳性细
胞比率，并按下述标准评分[6]：阳性细胞率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。

1.2.6 血清TNF-α、IL-10水平的测定：酶联免疫吸附法(ELISA)检测，按照相应试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。

计量资料用表示，采用单
因素方差分析和Dunnett-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 灌肠后大鼠的一般情况灌肠造模10～24 h后，G2、G3及G4组大鼠出现腹泻，解稀糊状便、水样便，伴黏液脓血，精神倦怠，皮毛无光泽，活动、进食减少；治疗后，G3、G4组上述症状逐渐缓解，但G2组症状无明显改善。

而G1组大鼠仅出现解水样便、糊状便，3～4 d后恢复正常。

整个实验期间，无大鼠死亡。

2.2 瑞巴派特对结肠炎大鼠各指标的影响治疗10 d 后，G3组结肠损伤大体评分、结肠组织LTB4水平较G2组显著降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性较G2组
显著升高(P<0.05)。

而G4组与G3组上述各指标相比，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.3 结肠组织COX-2、5-LOX表达在G1组的肠黏膜中，COX-2、5-LOX表达量极低；G2组的肠黏膜中可见大量胞质染黄色或棕黄色的炎性细胞。

G2组大鼠结
肠组织COX-2、5-LOX表达水平较G3、G4组明显增高(P<0.05)；G1组与其他
三组比较,差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图1)。

2.4 血清TNF-α、IL-10水平 G2、G3、G4组的血清TNF-α、IL-10水平明显高
于G1组(P<0.05)；G3、G4组的血清TNF-α、IL-10水平明显低于G2组
(P<0.05)；G3组与G4组相比，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

本实验发现,应用瑞巴派特治疗后，实验性结肠炎大鼠临床症状有所改善，且其大
体损伤评分明显降低，提示瑞巴派特对实验性结肠炎有一定的治疗作用，对肠黏膜
损伤具有保护作用。

Okayama等[5]用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate
sodium,DSS)诱导大鼠严重的结肠损伤，然后用瑞巴派特灌肠，发现由DSS诱导
的损伤得到改善，结肠的黏液含量明显提高，表明瑞巴派特对DSS诱导的大鼠结
肠炎有效,其保护作用在于自由基的清除和促结肠黏液分泌。

Miyata等[7]用瑞巴派特对1例抗生素及糖皮质激素耐药的重度隐窝炎患者进行2次/d的灌肠治疗(150 mg/次)，共8周，溃疡愈合，随访11个月无复发，未见不良反应。

氧自由基(oxygen free radicals，OFR)在UC发病机制中有重要作用。

McKenzie 等[8]发现UC患者活动期肠黏膜中有大量OFR产生，直接或间接损伤肠黏膜上皮细胞。

UC患者肠黏膜中抗氧化物质含量降低，上皮细胞对氧化损伤反应增强，增加肠黏膜的通透性[9]。

UC患者口服卵磷脂超氧化物歧化酶(PC-SOD)可明显改善
疾病活动指数，抗氧化剂治疗可减轻结肠炎动物模型肠道病理损伤，抑制或减少OFR有助于减轻炎性反应，保护上皮细胞，改善肠黏膜通透性[10-11]。

本研究发现，模型组大鼠肠道氧化损伤明显，表现为SOD和GSH-Px活性明显降低，瑞巴派特可显著上调SOD和GSH-Px活性，提示瑞巴派特具有明显抗氧化作用。

细胞因子在肠道免疫反应中起关键作用，致炎因子与抗炎因子之间的失衡均可导致炎症性肠病的发生。

研究[12]发现，UC患者血清及肠黏膜中TNF-α表达水平升高，提示TNF-α对UC发病有促进作用。

本实验发现经瑞巴派特治疗后，结肠炎
大鼠血清TNF-α水平明显下降。

Mitsuyama等[13]研究显示，活动性UC患者血清中IL-10含量与正常对照组比较明显升高，并在恢复早期仍然升高，直到炎症缓解后下降至正常水平。

本研究结果与其类似，经瑞巴派特、奥沙拉嗪治疗后，随着病情的缓解，IL-10呈不同程度的回落。

COX-2与5-LOX分别是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代谢的两条主要途径的关键酶。

COX-2与UC的炎症过程密切相关。

5-LOX可以催化AA生成LTB4。

LTB4作用在炎性细胞的LTB4受体上，主要介导炎性细胞向炎症部位趋化，对中
性粒细胞、单核细胞和效应性T细胞具有极强的趋化作用，被认为是UC中主要起作用的炎性介质[14]。

Mazzon等[15]敲除结肠炎模型小鼠的5-LOX基因，其炎
症程度明显减轻。

本研究显示，经瑞巴派特和奥沙拉嗪治疗后LTB4均明显降低，大鼠肠组织局部COX-2及5-LOX表达量显著降低，推测瑞巴派特和奥沙拉嗪可
能通过抑制肠组织局部COX-2及5-LOX表达，从而减轻肠组织局部黏膜损伤。

综上所述，瑞巴派特治疗实验性结肠炎大鼠有一定效果，其潜在的可能作用机制是上调结肠组织中SOD及GSH-Px的活性、调节细胞因子水平、减少局部COX-2
及5-LOX蛋白表达，从而减轻局部炎性反应强度而缓解炎症，但具体的作用机制仍需进一步的研究证实。

【相关文献】
[1]霍丽娟, 安丽婷, 师永盛. 美沙拉嗪联合双歧三联活菌治疗溃疡性结肠炎的临床疗效观察[J]. 中华
消化杂志, 2012, 32(8): 523-527．
Huo LJ, An LT, Shi YS. The clinical efficacy of mesalazine and bifid-triple viable combination therapy in patients with ulcerative colitis [J]. Chin J Dig, 2012, 32(8): 523-527．[2]李颉, 诸琦, 曹海霞, 等. 瑞巴派特对提高胃溃疡愈合质量的实验研究[J]. 中华消化杂志, 2008,
28(7): 451-455．
Li J, Zhu Q, Cao HX, et al. Effect of Rebamipide on the quality of gastric ulcer healing in rats [J]. Chin J Dig, 2008, 28(7)： 451-455．
[3]朱晚林, 叶秀津, 王章流, 等. 瑞巴派特保留灌肠治疗溃疡性结肠炎疗效[J]. 中国药师, 2009, 12(9): 1289-1290．
Zhu WL, Ye XJ, Wang ZL, et al. Therapeutic effect of Rebamipide enema retention therapy on ulcerative colitis [J]. China Pharmacist, 2009, 12(9): 1289-1290．
[4]Siddiqui A, Ancha H, Tedesco D, et al. Antioxidant therapy with N-acetylcysteine plus mesalamine accelerates mucosal healing in a rodent model of colitis [J]. Dig Dis Sci, 2006, 51(4): 698-705．
[5]Okayama M, Tsubouchi R, Nishio H. Protective effect of intra-rectal administration of rebamipide on dextran sulfate sodium-induced rat colitis [J]. Digestion, 2004, 70(4): 240-249.
[6]唐平飞，李瑾，贺文成，等. 吉法酯对三硝基苯磺酸诱导大鼠实验性结肠炎的作用[J].中华消化
杂志， 2009, 29(9)： 554-558.
Tang PF, Li J, He WC, et al. The effects of Gefarnate in treatment of rat model of colitis induced by trinitrobenzene sulphonic acid [J]. Chin J Dig, 2009, 29(9): 554-558. [7]Miyata M, Konagaya T, Kakumu S, et al. Successful treatment of severe pouchitis with rebamipide refractory to antibiotics and cortiecosteroids: a case report [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(4): 656-658．
[8]McKenzie SJ, Baker MS, Buffinton GD, et al. Evidence of oxidant-induced injury to epithelial cells during inflammatory bowel disease [J]. J Clin Invest, 1996, 98(1): 136-141.
[9]Buffinton GD, Doe WF. Depleted mucosal antioxidant defences in inflammatory bowel disease [J]. Free Radic Biol Med, 1995, 19(6): 911-918．
[10]Suzuki Y, Matsumoto T, Okamoto S, et al. A lecithinized superoxide dismutase (PC-SOD) improves ulcerative colitis [J]. Colorectal Dis, 2008, 10(9): 931-934. [11]Giris M, Depboylu B, Do ru-Abbaso lu S, et al. Effect of taurine on oxidative stress and apoptosis-related protein expression in trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis [J]. Clin Exp Immunol, 2008, 152(1): 102-110.
[12]Tian L, Huang YX, Tian M, et al. Downregulation of electroacupuncture at ST36 on TNF-alpha in rats with ulcerative colitis [J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(5): 1028-1033.
[13]Mitsuyama K, Tomiyasu N, Takaki K, et al. Interleukin-10 in the pathophysiology of inflammatory bowel disease：increased serum concentrations during the recovery phase [J]. Mediators Inflamm, 2006, (6): 26875.
[14]Hendel J, Nielsen OH. Expression of cyclooxygenase-2 mRNA in active inflammatory bowel disease [J]. Am J Gastroenterol, 1997, 92(7): 1170-1173.
[15]Mazzon E, Sautebin L, Caputi AP, et al. 5-lipoxygenase modulates the alteration of paracellular barrier function in mice ileum during experimental colitis [J]. Shock, 2006,
25(4): 377-383.。