大肠杆菌培养基配制及培养方法

大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养
一、菌种冻存液的制备
所含足量细菌的液体培养基Vergt后在结晶中重新加入等量40%甘油，-80oc冻存。

二、培养基制取
lb培养基配方（胰化蛋白胨（trypton）：10g/l；酵母提取物（yeastextract）：
5g/l；nacl：10g/l；ph7.4）
液体培养基
胰化蛋白胨10.0g酵母粉5.0g氯化钠10.0g水1000mlph7.4
液态培养基在液体培养基的基础上再重新加入1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制取
1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，加入800ml二次水溶解，并用
玻璃棒搅拌均匀，用1mol/l的naoh调ph至7.4左右，定容至1l，调ph7.4（若溶液ph
大于7.4，用1mol/lhcl回调）。

2）灌装在锥形瓶中，每瓶量不必太多，没有过瓶底一指左右。

例如须要液态培养基
在灌装后的液体培养基内重新加入约2%的琼脂（150ml液体培养基重新加入2.5g琼脂）。

3）在锥形瓶口依次全面覆盖拎滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋放进去。

所有锥
形瓶例如上述操作方式。

用记号笔标明培养基名称、酿制日期。

4）高压蒸汽杀菌锅121oc 杀菌15min。

5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oc烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。

液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15ml（直
径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。

将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。

6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待
需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。

四、接种大肠杆菌
1）挑实验室储备的大肠杆菌bl21冻存液，管口用酒精灯灼热，关上离心管。

2）注
射方法一：用杀菌枪头煮取冻存液在平板边缘上划出横条，每三道为一组，转动平皿一圈，最后中间划出之字；注射方法二：用移液枪汲取100ul溶液于平板上，用酒精灯杀菌薄的
涂抹棒划十字，涂敷平板。

3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过
大应适当稀释。

一般方法一获得单菌落的可能性比较大。

涂平板应在酒
精灯附近展开，若冻存液涂回去的平板应当倒转，避免平皿砌上产生水蒸气。

五、大肠杆菌的培育
1）将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。

2）挑取生长状态不好，特征显著的单个菌落，注射于新鲜杀菌的lb液体培养基中37℃，220rpm/min恒温震荡培育9-12h。

菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面扁平，表面和背面颜色一致。