最新 流式细胞术测定Survivin基因在大肠癌中的表达及

流式细胞术测定Survivin基因在大肠
癌中的表达及其意义
作者：王淑强李鹏武欣郝秀轻李秀娟
【摘要】目的：研究Survivin基因在大肠癌中的表达及其与肿瘤发生、发展的关系。

方法：流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测58例大肠癌(Colorectal carcinoma,CC)患者及10例正常者黏膜(Normal mucosa,NM)中Survivin表达情况，并结合临床病理相关因素，应用SPSS11.0统计软件进行
统计学分析。

结果：FCM定量检测表明，正常黏膜组Survivin表达平均FI值
为1.00±0.28，高、中、低分化腺癌及粘液腺癌组Survivin表达FI值分别为3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06。

高、中、低分化腺癌及粘液腺癌组Survivin表达均明显高于正常黏膜组(P<0.05)。

大肠癌淋巴结转移组平均FI值3.11±1.19，显著高于无淋巴结转移组2.26±1.38(P<0.05)。

FCM 结果显示Survivin表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位等无关
(P>0.05)。

结论：Survivin在大肠癌中表达异常增高，显著高于正常肠黏膜组织。

Survivin在大肠癌中的表达与淋巴结转移密切相关。

【关键词】大肠癌;Survivin基因;流式细胞术
【ABSTRACT】 Objective:To investigate the expression of survivin in coloreatal carcinomas and relationship between its expression and tumorigenesis and development.Methods:The expression of Survin was studied in 58 cases with human colorectal carcinomas and 10 cases with normal colorectal carcinoma by FCM analysis.The clinical pathological significances of surbvivin expression in CC were statically analyzed by SPSS 11.0 software.Results:FCM results showed that Survivin expressions in well moderately and pooly differentiated CC colorectal carcinoma were.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48 and
3.31±1.06 respectively,which were all significantly higher than that of NM(1.00±0.28).The FI of surviving expression in CC cases with LNM and that without LNM were 3.11±1.19 and 2.26±1.38 respectively.The former was significantly higher than that of the later one(P<0.05).No remarkable correlations were found between surbvivin expression and other clinical pathological factors,such as age、sex or tumor
protein level in colorectal carcinoma were significantly increased than that in normal colorectal mucosa. The expressions of the three mathers were increased in cases with LNM than that without LNM. The increased survivin expression in colorectal carcinoma was closely related to lymphnode metastasis.
【KEY WORDS】 Colorectal Carcinoma,Survivin,Flow Cytometry
大肠癌是常见消化道恶性肿瘤之一，患者的主要死亡原因是术后转移。

近年来研究表明，Survivin在多种肿瘤中都是高表达，在肿瘤发生、发展、分化、转移中起重要作用。

本实验采用流式细胞术检测58例大肠癌及10例大肠远端病理证实为正常黏膜(Normal mucosa,NM)中Survivin的表达情况，探讨其在大肠癌发生、发展和转移中作用，为大肠癌浸润和转移预测、预后判断提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料
收集河北北方学院附属第一医院—月间手术切除的大肠癌标本58例，同时选取大肠远端病理证实为正常黏膜组织10例。

58例大肠癌中男性28例，女性30例;年龄30～78岁;发生部位，结肠癌22例，大肠癌36例;组织分化程度：高分化腺癌26例，中分化腺癌20例，低分化腺癌6例，粘液腺癌6例;有淋巴结转移31例，无淋巴结转移组27例。

所有标本蜡块均进行4～5μm连续切片，HE染色病理确诊。

将剩余蜡块再进行切片做流式。

1.2 主要试剂兔抗人Survivin多克隆抗体，羊抗兔显色剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 试验方法
1.3.1 单细胞悬液的制备
①把石蜡包埋组织切成40μm厚的组织切片，放入10mL的试管中。

②加入二甲苯8mL，在室温下脱蜡2d，期间更换二次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯。

③水化，依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5mL，每步10min，加入DW 5mL，10min弃之。

④消化，加入2mL 0.5%胰蛋白酶(pH=1.5)，置37℃恒温水浴中消化
30min，在消化期间每隔10min，用振荡器震荡1次，消化30min，立即加生理盐水终止消化。

⑤经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可经第二次消化。

⑥收集细胞悬液，以1500r/min离心沉淀5min，生理盐水漂洗二次，以800r/min离心沉淀5min，去碎片。

1.3.2 细胞免疫荧光标记
取单细胞悬液1×106/mL,加入兔抗人Survivin多克隆抗体标记工作液0.1mL,室温孵育30min，加入PBS 10mL，洗涤一次，弃上清，加入羊抗兔
二抗工作液100μL，避光室温孵育30min，加入PBS 10mL，离心同上，弃去上清，除去未结合的荧光抗体，上机检测前加入PBS 0.1mL，经500目铜网过滤后上机检测，在对蛋白免疫荧光标记物测定时，设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。

1.3.3 流式细胞仪检测条件及参数，采用美国Beckman Coulter公司生产的型流式细胞仪，应用Expo32ADC软件进行免疫荧光数据分析，测定前以标准微球调整仪器CV值在2%以内。

1.4 结果测定以流式细胞仪分析软件给出的每例样品的平均荧光强度(Mode值)，计算荧光指数(fIuorescence Index,FI)，并以荧光指数显示Survivin基因蛋白表达强弱并进行相关的数据分析。

FI计算公式：FI=(样本基因蛋白表达荧光强度-正常样品的荧光强度)/正常样品的荧光强度。

1.5 统计学方法数据库的建立和数据分析采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，Survivin基因表达的流式细胞仪检测结果进行单因素方差分析，
P<0.05有统计学差异。