3总RNA的提取,电泳鉴定及RT-PCR
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4)室温孵育10 min。
播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项
室温孵育10 min介绍
RNA提取的几种方法 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解 细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性， 通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总 RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。
实验操作 三、 PCR产物的电泳
1. 教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。 2. 样品制备：
在50 l PCR产物中，加入 6 ul 上样液，混匀。
（上样液：10×Loading buffer 或 6×Loading buffer）
3. 上样：
将上述样品加入凝胶加样孔中。
注意：DNA Marker。
用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。 当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。
11)室温干燥3－5 min （根据 RNA 沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无 色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）
注意事项： RNA: 避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无 法溶解。
有声课件3: RT 的原理和注意事项
逆转录
mRNA AAAAAA(n) 10min 68-70oC, annealing mRNA AAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-5 1-2h 37-42oC, RTase mRNA
cDNA
AAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-5
第一步： 打开RNA链之间的二级结构， 使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。
避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体
判断溶解程度：
吹打时液体流动不拐弯 为止。
13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳). 14) 剩余 9 l溶液,放到冰上备用（将用于RT－PCR）.
实验二. RNA 的琼脂糖凝胶电泳
RNA 的琼脂糖凝胶电泳
基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必 须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶 液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理 以尽量减少RNA酶对样品的降解
RNA的电泳上样：
RNA样品： 上样缓冲液： 4.5 l 1 l
混匀后， 5.5 l 直接电泳上样（100伏，10－30分钟） 上样前预电泳5min。 注意: 电泳槽的清洁！ 所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果
RNA电泳结果
rRNA可以作为内部 Marker分子，通过观察rRNA 的两条带（28S和18S）的比 例，可以判断所提取mRNA是 否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA 是否提取成功，也不作为鉴 定RNA提取质量的常规方法， 因为在电泳过程中RNA可能发 生降解。
RNA电泳结果分析
分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。
实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR)
逆转录反应原理
逆转录酶：
存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类 型42oC 。
以mRNA为模板的DNA聚 合酶，形成与RNA碱基相互补 DNA链，后者称为互补DNA－ cDNA。 RNAaseH的活性：切掉 DNA和RNA杂合链上的RNA。
第三步：将上述反应移至68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用
午 休
目的基因片断的体外扩增
实验操作内容
— PCR反应体系的建立
— PCR 反应的进行
有声课件
（1）： PCR的基本原理 及反应体系的组成 PCR反应动画 （2）：PCR 反应条件的 确定及PCR常见问题的解 决方案
RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留， 容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成 RNA不溶解的主要原因 。
判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过 分干燥是逆转录成功的关键环节。
RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明
12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA 上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心 充分，一定要用加样器反复多次吹打方 可。但由于溶液体积非常小，要避免出 现气泡影响RNA的溶解。
实验操作五、PCR产物的回收
挤胶法回收PCR产物：
PCR电泳结果
Marker 1 2
（ 1 ）在 UV 灯下，用手术刀片 将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶切 下，放入封口膜中；
2000bp 1000bp 750bp 500bp
（2）将切下来的胶块，标记好 姓名，-20℃冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压， 用加样器吸取挤压后得到的液 体。
— PCR产物的电泳
— 结果观察与分析
— PCR产物回收
实验操作一、建立 PCR 反应体系
1. 取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中， 用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂： 1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l 2）加入下列试剂,，顺序可以改变
5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s， 室温放置5 min （此期间液体开始分层，不 要轻易搅动液体）。
6)10000 rpm， 离心 5 min
Protein
RNA (清澈透明) DNA
7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
有声课件2: RNA干燥及溶解技巧
8) 沉淀RNA： 加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，离心10 min．弃上清。 ９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉 淀) 10) 7500rpm，4C 离心 1 min，弃上清． 再离心几秒钟， 将管壁液体（用加样器）完全移净。
10X PCR buffer (含MgCl2 )
dNTPs (10mM) 3 ’引物 (10mol/L)
5 l
1 l 1 l
5 ’引物 (10mol/L)
3）加去离子水 ，补足50l最终反应体系 4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。
1 l
1 l
注意： （1） PCR相关试剂均放在每排实验台上方中 间位置处的蓝色 圆盒中
（2）加样的体积要准确，1 l 的体积不应该 超过白色枪头的第一个格。
实验操作二、 PCR 反应的进行
1、将样品放入 PCR 仪中 2. PCR反应条件
94 ℃ 55 ℃ 30 S 30 S DNA变性 (Denaturation) 退火 (Annealing)
总RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65℃水浴10min， 立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。
第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂 5RT-buffer RNasin (RNA酶抑制剂，40U/ml) dNTPs (10mmol/L) AMV （逆转录酶） 轻弹管底混合。置42 oC 水浴1h。 4 1 4 1 l l l l
72 ℃
45 S
延伸 (Extension)
上述温度变化进行 30 个循环 (cycles) 。 72 ℃ 10 min (Further extension)。
3. 将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。 其它同学课间休息。
播放：有声课件 （PCR讲解1） 播放：PCR 动画
播放：有声课件 （PCR讲解2）
250bp 100bp
GAPDH gene 片段 (746bp)
思考题：
1. PCR反应的第几个循环开始出现符合预期长度的 目的DNA片段？请画图说明。
2. 用Taq DNA聚合酶进行PCR时，获得的PCR产
物的末端都有哪些情形？T-A连接的原理是什么？ 影响连接效率的因素有哪些？
实验结束后整理实验台, 值日生值日!
RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。
三、RNA提取的实验操作
1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。
2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3) 将研磨后的组织 ( 小米粒大小 ) 转移至 1 mL Trizol 试 剂 中 ， 盖 紧 盖 ， 上 下 颠 倒 混 合 2 min 以 上 。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑 浊状。
3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 小亚基40S: 18S=1874nt
二、RNA提取的注意事项
RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。
4. 电泳：100 伏，30分钟。
操作四、PCR产物的电泳结果观察及分析
Marker 1 2
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
？ GAPDH gene 片段 (746bp)
？
（1）观察： 蓝色箭头指示的是何种DNA ？ （2）此PCR 结果存在什么问题？ 原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？
RNase抑制剂
1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐) 最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合， 使蛋白质变性。 有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。 灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 2、肝素： 使用浓度：0.1—10mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制效果。
实验二、 RNA提取及RT-PCR
实验内容
1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收
实验一.
提取小鼠肝脏组织的RNA
一、真核细胞的总RNA
1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 5S=120nt 5.8S=160nt
播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项
室温孵育10 min介绍
RNA提取的几种方法 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解 细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性， 通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总 RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。
实验操作 三、 PCR产物的电泳
1. 教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。 2. 样品制备：
在50 l PCR产物中，加入 6 ul 上样液，混匀。
（上样液：10×Loading buffer 或 6×Loading buffer）
3. 上样：
将上述样品加入凝胶加样孔中。
注意：DNA Marker。
用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。 当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。
11)室温干燥3－5 min （根据 RNA 沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无 色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）
注意事项： RNA: 避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无 法溶解。
有声课件3: RT 的原理和注意事项
逆转录
mRNA AAAAAA(n) 10min 68-70oC, annealing mRNA AAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-5 1-2h 37-42oC, RTase mRNA
cDNA
AAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-5
第一步： 打开RNA链之间的二级结构， 使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。
避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体
判断溶解程度：
吹打时液体流动不拐弯 为止。
13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳). 14) 剩余 9 l溶液,放到冰上备用（将用于RT－PCR）.
实验二. RNA 的琼脂糖凝胶电泳
RNA 的琼脂糖凝胶电泳
基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必 须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶 液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理 以尽量减少RNA酶对样品的降解
RNA的电泳上样：
RNA样品： 上样缓冲液： 4.5 l 1 l
混匀后， 5.5 l 直接电泳上样（100伏，10－30分钟） 上样前预电泳5min。 注意: 电泳槽的清洁！ 所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果
RNA电泳结果
rRNA可以作为内部 Marker分子，通过观察rRNA 的两条带（28S和18S）的比 例，可以判断所提取mRNA是 否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA 是否提取成功，也不作为鉴 定RNA提取质量的常规方法， 因为在电泳过程中RNA可能发 生降解。
RNA电泳结果分析
分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。
实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR)
逆转录反应原理
逆转录酶：
存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类 型42oC 。
以mRNA为模板的DNA聚 合酶，形成与RNA碱基相互补 DNA链，后者称为互补DNA－ cDNA。 RNAaseH的活性：切掉 DNA和RNA杂合链上的RNA。
第三步：将上述反应移至68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用
午 休
目的基因片断的体外扩增
实验操作内容
— PCR反应体系的建立
— PCR 反应的进行
有声课件
（1）： PCR的基本原理 及反应体系的组成 PCR反应动画 （2）：PCR 反应条件的 确定及PCR常见问题的解 决方案
RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留， 容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成 RNA不溶解的主要原因 。
判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过 分干燥是逆转录成功的关键环节。
RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明
12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA 上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心 充分，一定要用加样器反复多次吹打方 可。但由于溶液体积非常小，要避免出 现气泡影响RNA的溶解。
实验操作五、PCR产物的回收
挤胶法回收PCR产物：
PCR电泳结果
Marker 1 2
（ 1 ）在 UV 灯下，用手术刀片 将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶切 下，放入封口膜中；
2000bp 1000bp 750bp 500bp
（2）将切下来的胶块，标记好 姓名，-20℃冰箱中 。 （3）放在封口膜内直接挤压， 用加样器吸取挤压后得到的液 体。
— PCR产物的电泳
— 结果观察与分析
— PCR产物回收
实验操作一、建立 PCR 反应体系
1. 取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中， 用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂： 1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l 2）加入下列试剂,，顺序可以改变
5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s， 室温放置5 min （此期间液体开始分层，不 要轻易搅动液体）。
6)10000 rpm， 离心 5 min
Protein
RNA (清澈透明) DNA
7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。
有声课件2: RNA干燥及溶解技巧
8) 沉淀RNA： 加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，离心10 min．弃上清。 ９) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉 淀) 10) 7500rpm，4C 离心 1 min，弃上清． 再离心几秒钟， 将管壁液体（用加样器）完全移净。
10X PCR buffer (含MgCl2 )
dNTPs (10mM) 3 ’引物 (10mol/L)
5 l
1 l 1 l
5 ’引物 (10mol/L)
3）加去离子水 ，补足50l最终反应体系 4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。
1 l
1 l
注意： （1） PCR相关试剂均放在每排实验台上方中 间位置处的蓝色 圆盒中
（2）加样的体积要准确，1 l 的体积不应该 超过白色枪头的第一个格。
实验操作二、 PCR 反应的进行
1、将样品放入 PCR 仪中 2. PCR反应条件
94 ℃ 55 ℃ 30 S 30 S DNA变性 (Denaturation) 退火 (Annealing)
总RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65℃水浴10min， 立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。
第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂 5RT-buffer RNasin (RNA酶抑制剂，40U/ml) dNTPs (10mmol/L) AMV （逆转录酶） 轻弹管底混合。置42 oC 水浴1h。 4 1 4 1 l l l l
72 ℃
45 S
延伸 (Extension)
上述温度变化进行 30 个循环 (cycles) 。 72 ℃ 10 min (Further extension)。
3. 将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。 其它同学课间休息。
播放：有声课件 （PCR讲解1） 播放：PCR 动画
播放：有声课件 （PCR讲解2）
250bp 100bp
GAPDH gene 片段 (746bp)
思考题：
1. PCR反应的第几个循环开始出现符合预期长度的 目的DNA片段？请画图说明。
2. 用Taq DNA聚合酶进行PCR时，获得的PCR产
物的末端都有哪些情形？T-A连接的原理是什么？ 影响连接效率的因素有哪些？
实验结束后整理实验台, 值日生值日!
RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。
三、RNA提取的实验操作
1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL Trizol 试剂移入Eppendorf管中。
2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3) 将研磨后的组织 ( 小米粒大小 ) 转移至 1 mL Trizol 试 剂 中 ， 盖 紧 盖 ， 上 下 颠 倒 混 合 2 min 以 上 。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑 浊状。
3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 小亚基40S: 18S=1874nt
二、RNA提取的注意事项
RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。
4. 电泳：100 伏，30分钟。
操作四、PCR产物的电泳结果观察及分析
Marker 1 2
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
？ GAPDH gene 片段 (746bp)
？
（1）观察： 蓝色箭头指示的是何种DNA ？ （2）此PCR 结果存在什么问题？ 原因？你拟采用哪些措施解决上述问题？
RNase抑制剂
1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐) 最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合， 使蛋白质变性。 有效浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。 灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 试剂的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 2、肝素： 使用浓度：0.1—10mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制效果。
实验二、 RNA提取及RT-PCR
实验内容
1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳 3、以RNA为模板进行RT-PCR 4、 PCR产物的电泳及回收
实验一.
提取小鼠肝脏组织的RNA
一、真核细胞的总RNA
1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 5S=120nt 5.8S=160nt