植物细胞的信号传导

免疫转移电泳实验（Western blot assay）
利用抗原抗体结合原理，先用SDS-PAGE分离样品，转移到NC膜（nitrate cellulose）上，然后先用一抗体温育，再用125I标记的蛋白A或酶标二抗温育，最后用放射自显影或酶底物显色，指示G蛋白的存在。目前用动物的G蛋白抗体来检测植物G蛋白，但不是所有在的植物G蛋白都可用动物的G蛋白的抗体能检测出来。
接受信号主要通过蛋白受体或改变膜电位
受体位置
光敏色素组成一个蛋白质家族，各有不同生理功能
光反应红光受体
PART 1
光形态建成中信号传导效应的复杂性
第二节 植物细胞跨膜信号转导
受体(receptor)：
具有特异性、高亲和力、可逆性等特点。
是在效应器官细胞表面或亚细胞组分中可特异地识别并结合信号分子—配体(ligand) ,或物理信号（光温信号）大分子物质，多为为蛋白质。
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02
GTP结合实验（GTP—binding assays），G蛋白可以结合GTP。标记GTP可以检测G蛋白。
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01
B.将G蛋白的样品用SDS—PAGE分离后转膜，再与带放射性标记的非水解的GTP类似物或标记α位磷酸的GTP[（α32p）GTP] 保温放射自显影。但异三聚体G蛋白的小G蛋白及其他GTP结合蛋白都与GTP结合，故这种GTP标记还不能区别G蛋白属于哪一类，但可在样品的制备时进行预处理，如利用超滤Centricone 可以鉴别异三聚体G蛋白和小G蛋白。
Glucocorticoid steroid receptors
蜕皮激素
受体种类： 细胞内受体，是指存在于亚细胞组分中的受体； 细胞表面受体(cell surface receptor)，可分三类： 离子通道偶联受体(ion-channel-linked receptor) G蛋白偶联受体 酶偶联受体 既有信号结合位点，又是离子通道，跨膜信号转导无需中间步骤，又称配体门控离子通道，分布有组织特异性。
初级信使
膜上信号转换系统
第二信使
cAMP
Ca2+
IP3
DAG
Ca2+ 调节蛋白
PKA
PKCa2+ ·CaM
PKCa2+
PKC
酶 蛋 白 磷 酸 化 修 饰
细 胞 反 应
CaM
胞间信号传递
膜上信号转换
胞内信号转导
蛋白质可逆磷酸化
6 Signal perceiving
To initiate transduction, the signal must be Senesced by receptor or changing membrane potential Regulate receptor concentration can change the sensitivities of cell to signal Many receptors when bind its ligand (signal) active protein kinase and protein phosphatase activities Intracellular receptors can act as ion channel
Plant cells containing two information system genetic and epigenetic
1DNA –RNA-Protein (phenotype )
4.2 many phenotype are strongly modified by environmental factor and gene respond environmental stimulates are epigenes have pleiotropic function
动物细胞中三种受体
IP3的受体
另两种受体（细菌，乙烯受体）：双分子系统和杂合酶系统
光敏色素组成一个蛋白质家族，各有不同生理功能
光反应红光受体
PART 1
1．植物G蛋白
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01
GTP
ATP cAMP+PPi
01
03
02
5 two major signal transduction pathway in plant
Cytosolic Calcium Protein kinase /phosphorylase
环 境 刺 激
胞 间 信 号
受体
G蛋白
效应器
细胞外
细胞膜
细胞质
酪氨酸蛋白激 酶
植物种类
分子量（KD）
植物种类
分子量（KD）
拟南芥
31-36
大豆
45
燕麦
24
大麦
22-36
衣藻
24
水稻
28-30
杜氏盐藻
ห้องสมุดไป่ตู้28
豌豆
24-43
蚕豆
31-37
玉米
27-34
2．检测到的G蛋白
Plant materials for Signal transduction “植物中的果蝇”。
拟南芥（Arabidopsis thaliana） 十字花科。 二年生草本，高7～40厘米。基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。长角果线形，长1～1.5厘米。花期3～5月。我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的优点是植株小（1平方厘米可种植好几棵）、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多（每棵植物可产很多粒种子）、生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000
受体位置
The receptor for glucocorticoid hormone (cortisol糖皮质激素 ) differs from the others in that it is located in the cytosol, anchored in an inactive state to a cytosolic protein. Binding of the hormone causes the release of the receptor from its cytosolic anchor, and the receptor–hormone complex then migrates into the nucleus, where it binds to the enhancer and stimulates transcription (Figure)
A.异三聚体G蛋白的基因克隆
植 物
基 因
拷 贝 数
产 物
拟 南 芥
gpa1
单拷贝
GPα1
番 茄
tga1
单拷贝
GPα1
衣 藻
cb1p
--
WD-40(重复的二级结构)
玉 米
zgb1
单拷贝
Gβ
拟 南 芥
agb1
单拷贝
Gβ
（2）G蛋白基因的克隆
（2）检测G蛋白的生化方法
将G蛋白的样品与带放射性标记的非水解的GTP类似物一起保温进行标记，以放射性强度高低来说明G蛋白活性的大小。
C
C
A
B
C
α
β
GDP
γ
α
β
GDP
γ
α
β
GTP
γ
腺苷酸环化酶
C
G 蛋白
R
R
R
A.异三聚体G蛋白 动物G蛋白由α、β和γ三个亚基组成。天然的 G 蛋白中β与γ亚基总是紧密联系在一起，α亚基分子是在39--46KD之间。α亚基的差别较大，是G蛋白的分类依据，具有一共同的GTP结合位点，和有GTP酶的活性，即可以把GTP水解成GDP和无机磷酸。α亚基上有些特殊的氨基酸（Arg或Cys）残基可被特定的细胞毒素所修饰，从而调节细胞生理功能。已经克隆的Gα蛋白的cDNA，发现G 蛋白的一级结构中高度保守的结构区域，即P区域，G´区域和G区域，P与G´区域都与GTP结合及与GTP酶活力有关；G区域则与GTP结合，并与腺苷酸环化酶相互作用有关。β亚基的分子量为36KD左右。但植物上至今尚未发现有γ亚基存在，不过人们依据已克隆到的基因序列分析，推测植物中有γ亚基存在。
（1）植物G蛋白种类及结构
Mechanism of G protein
B．小G蛋白的（small GTP-binding protein）为单体，仅20-30KD。微管蛋白β亚基也是一种小G蛋白。
G蛋白在结构上没有跨膜蛋白的特点，它们能够固定在细胞膜内侧，主要是通过对其亚基上氨基酸残基的脂化修饰发生作用。
3Finally modified gene expression
Different signal effects Different transduction networks in different way and different place But finally change the gene expression pattern
第二章 植物细胞信号转导
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生长和发育是基因在一定时间、空间上顺序表达的过程，而基因的表达同时受到内外环境的调控。 植物细胞信号转导(signal transduction)： 是植物感受、传导环境分子的刺激及其在发育过程中调控基因的表达和生理生化反应，包括信号、受体、信号转导网络和反应等环节。
第一节 Over view of signal transduction
The stream of signals is continuous and complex
2 Signal transduction network within cells, among Cells and through the plant
An example of intracellular receptor
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Glucocorticoid steroid receptors are transcription factors. Glucocorticoid hormone is lipophilic and diffuses readily through the membrane to the cytosol. Once in the cytosol, the hormone binds to its cytosolic receptor, causing the release of an inhibitory protein from the receptor. The activated receptor then diffuses into the nucleus. In the nucleus, the receptor–hormone complex binds to the enhancer regions of steroid-regulated genes. Transcription of the genes is stimulated. (From Becker et al. 1996.)
GTPase活性实验（GTPase assay），G蛋白除了能与GTP结合外，还具有内在的GTPase活性。通常在待测样品中加入γ位磷酸标记GTP [（γ32p）GTP]，测定液相中32P放射性强度来表示GTPase活性的大小。同样不能分辨出G蛋白属于哪一类。
细菌毒素诱导的核糖基化实验（ADP—ribosylation assay） 一些细菌毒素可以使异三聚体Gαcys 残基ADP--核糖基化。如将ADP--核糖基用放射性标记，则G蛋白上就带上该放射性标记。一般方法先用32P 标记NAD+（作为ADP--核糖基的供体），再把细菌毒素和蛋白样品一起保温一定时间后，取回蛋白用SDS—PAGE分离后放射后显影。如百日咳毒素（pertussis toxin, PTX）和霍乱毒素（cholera toxin, CTX）。PTX能使所有位于异三聚体Gα C末端的Cys的残基ADP-核糖基（ADP-adenosine diphosphate 腺苷二磷酸）化，且专一性强，不受样品中其他蛋白或ADP核糖基因子（ARFs）的影响。