ggn3与二噁英诱导表达蛋白ggnbp2的相互作用

Ｈ女Ｂｇ！生｝Ｂ暨∞２蛆ｉ
１．４ＧＧＮＢＰ２基因的研究背景：
ＧＧＮＢＰ２（又称做Ｄｉｆ一３、ＺＦＰ４０３）是一个经ＴＣＤＤ（２，３，７，８一四氯二苯并～对一二恶英）诱导可在胚胎干细胞（Ｅｓ）中表达的基因。

它是通过减法杂交技术分离获得的“”。

实验证明二恶英可在Ｅｓ细胞中诱导ＧＧＮＢＰ２的表达而且随剂量的增加表达也上升，而且它的诱导表达是ＡｈＲ依赖型，这与一般的多卤素化芳烃和多环芳烃的作用机制相似”“。

正常生理条件下，ＧＧＮＢＰ２仅在睾丸中表达，但它不参与睾丸的早期发育，而是在在初级精母细胞的粗线期表达最高，而在精细胞中没表达，所以推测它参与精子的早期生成过程ｏ”。

Ｂ本学者融ａｓａｈｉｋｏＫｕｒｏｄａ分析表明ＧＧＮ８ｐ２其有一个Ｃ２Ｈ２锌指结构、一个碱性区和一个酸性区域，并且根据寥抗组织染色表明ＧＧ惦Ｐ２是一罩孛核因子，（我们存在疑义）
图１．４ＧＧＮＢＰ２结构示意图
Ｆｉｇ１．４ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＧＮＢＰ２
１．５ＴＣＤＤ作用的分子生物学机制：
ＣｌＣＩＣＩＣＩ
ＴＣＤＤ（２，３，７，８－四氯二苯并一对一二嗯英）是多卤素化芳烃（ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ＨＡＨ）家族中的一个典型代表。

”。

ＨＡＨ通常具有相似的作用机制及毒理学效应，但不同成员的毒性却存在一定差异，ＴＣＤＤ是其中毒性最大和生物活性晟活跃的一个。

ＴＣＤＤ是在２０世纪７０年代在除草剂橙剂（ＡｇｅｎｔＯｒａｎｇｅ）发现的，它广泛的分布于环境污染物中并且能够稳定存在。

由于机体通常不具有能够代谢ＴＣＤＤ相关的酶类，所以在体内它也能够长期稳定存在，可以通过食物链传递给其他个体得
４
整二兰盟童——
图１．６ＡｈＲ介导的基因表达示意图
Ｆｉｇ１．６ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｗｉｔｈＡｈＲ１．６蛋白质相互作用研究方法及原理：
基因是遗传信息的载体，而蛋白质是遗传功能的最终执行者。

多聚蛋白的形成需要蛋白亚基间的相互作用；细胞中很多蛋白功能要在相应的复合体中才能行使它的功能（如脂肪酸合成酶复合体、几乎所有的转录复合物和ＤＮＡ复制复合物等），这些复合物的建立也需要依靠蛋白质间的相互作用；另外，实验证明即使一些单体蛋白在细胞中也不是以游离念存在的，很多蛋白都与骨架结构结合。

它们也存在蛋白相互作用，可见说有机体中蛋白质的相互作用是广泛的，而且具有重要的生物学意义，美国科学家已经通过使用酵母双杂交技术绘制了果蝇的的蛋白质作用于网络图，也证明了在体内蛋白质相互作用是广泛存在的。

蛋白通过组合形成更为多样的功能复合物，这大大扩增了基因的信息量。

另外由多蛋白组成功能复合物也是一种有效地细胞调控方式，它可以通过蛋白的聚和散对复合物功能进行开和关，它无需降解蛋白是一种节约的方式。

目前，已经建立了许多研究蛋白质间相互作用的研究方法，被广泛的应用于细胞周期调空、信号传导和肿瘤相关基因分离的研究中。

现对经常使用的蛋白质相互作用研究方法及其原理作一简介。

１．６．１酵母双杂交技术（ｙｅａｓｔｔｗｏ－－ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ）“”…：
酵母双杂交具有灵敏度高、功能强大、试用范围广等特点，它可以验证已知蛋白间的相互作用，也可以高通量的筛选与已知蛋白相互作用的蛋白。

真核生物基因转录激活有一个特点：转录因子的转录激活作用是由功能相互独立的ＤＮＡ结合结构域（ＢＤ）和转录激活结构域（ＡＤ）通过共价或非共价相互作用联系在
６
第一章前言
哺乳动物细胞双杂交是Ｐｒｏｍｅｇａ公司基于荧光检测技术，建立起来的一套在哺乳动物细胞内检测蛋白相互作用及其作用强度的系统，它是在体内检测蛋白一蛋白相互作用的非常灵敏的一种方法，被应用于确认两个蛋白质有怀疑的相互作用关系及寻找蛋白作用的区域。

与酵母双杂交原理相似，双杂交系统建立的基础是在一些转录因子上发现的模域（ｍｏｄｕｌａｒｄｏｍａｉｎｓ）：一个ＤＮＡ结合域（ＢＤ），它可以结合一段特异的ＤＮＡ序列，和一个转录激活域，这个转录激活域与基础转录机制相作用。

一个转录激活域联合一个ＤＮＡ结合域可能在ＴＡＴＡ盒启动ＲＮＡ聚合酶ＩＩ复合体的装配，同时增强转录。

例如，在ＣｈｅｃｋＭａｔｅ“哺乳动物双杂交系统中，ＤＮＡ结合域（ＧＡＬ４）和转录激活域（ＶＰｌ６）分别由不同质粒产生，融合于ＤＮＡ结合域的一个蛋白质Ｘ与融合于转录激活域的第二个蛋白质Ｙ相互作用时，ＤＮＡ结合域就与转录激活域紧密连接在一起，导致报告基因（萤火虫荧光素酶，ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）的转录。

同酵母双杂交相比，它具有以下特点：１）使用哺乳动物细胞系统：可在所选细胞系中研究相互作用，蛋白质更可能处于其本来构型。

更好地保持了诸如糖基化、磷酸化和酰基化等翻译后的修饰，减少假阳性；２）易于定量：Ｄｕａｌ—Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ双荧光素酶报告基因检测系统被用于检测；３）具有内对照：海肾荧光素酶使转染效率正态化；４）快速瞬时检测：转染后两天即可得到结果，而酵母系统则需３—４天：５）可获得稳定转染细胞：ｐＡＣＴ载体含有新霉素磷酸转移酶基因，可用于稳定转染的选择。

图Ｉ，９哺乳动物细胞双杂交示意图
Ｆｉｇ１．９ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｔｗｏ—ｈｙｂｒｉｄ
１．６．４细胞免疫荧光共定位技术“１：
以不同荧光物质分别标记待检测的两种目标蛋白。

观察它们在细胞中的定位，并通过影像重叠技术观察两种不同荧光的重叠效果，理论上讲相互作用的两种蛋白的应该是完全重叠的。

可以通过两种方法进行蛋白的荧光标记：
一、构建荧光蛋白——目的蛋白融合蛋白，显示蛋白位置。

有些蛋白在激发光作
８
第一章前言
图１．１ｌ免疫共沉淀示意图
Ｆｉｇ１．１１ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＣｏ—ＩＰ
１．６．７问接检测方法：
实验中，往往由于没有合适的检测工具而不能使用以上方法直接检测蛋白间的相互作用，例如在检测体内蛋白相互作用时若使用细胞共定和免疫共沉淀，则需要特异性要高的抗体，由于当前可以商业获得的高质量抗体还非常有限，所以对于～些新发现的新基因，很难短时间被获得其高特异性的抗体，在这种情况下则可以使用间接的方法检测蛋白间的相互作用。

间接法的原理是：使用一定方法对细胞或组织均浆液进行分级分离，然后使用一些方法检测所研究蛋白的分布区段（可以使用ＷＢ，这种方法对抗体特异性要求低些），相互作用的蛋白其分布区段应该是相同的。

实验中可使用密度梯度离心、分子筛层析等较温和不破坏蛋白相互用的方法进行分级分离。

只是一种间接鉴定相互作用的方法，它可以作为体外已经鉴定为相互作用蛋白在体内相互作用的佐证，如最近ＭｅｅｔｅｉＡＲ使用分予筛层析分段分离的方法鉴定了ＦＡＮＣＬ为范康尼氏贫血症复合物中Ｅ３泛素连接酶［９】。

Ａ
Ｂ
Ｃ
图１．１２闻接检测方法示意图
Ｆｉｇ１．１２ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ
第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制备、纯化及其检测
１．３．７细胞培养基本操作（以贴壁细胞为例）：
１１操作准备：每次操作前，操作台要用３０Ｗ紫外灯照射２０－－３０ｍｉｎ，进行表面消毒；用７５％酒精擦拭手；打开排风机，并点燃酒精灯。

２１换液、记数及传代：通常细胞置于３７。

ＣＣ０２培养箱中，箱内稳定供应５％Ｃ０２以调节培养基ＰＨ值，如营养耗尽，则需要更换培养基。

当细胞长满时也需要进行传代，操作如下：①弃掉旧培养基，加入约ｌｍｌＯ．２５％胰酶（有些难以消化的细胞可以先用１×ＰＢＳ洗掉培养基），倒掉胰酶，将剩余胰酶在细胞表面铺展开，消化直至细胞开始呈现脱落（一般需要２—５ｍｉｎ，每种细胞都有其
特定的消化时间，需在平时通过镜下观察摸索）。

②加入
含血清完全ＤＭＥＭ培养基约１０ｍｌ，终止消化反应（血
清可抑制胰酶活性），并用吸管将细胞吹匀，注意尽量减
少气泡产生。

③计数：用吸管将细胞吹匀后立即吸取１０ｕｌ
细胞悬液，加到细胞计数板上，取四个角上大方格（图
一大圆圈为其中一格，其中又有１６个小格）内细胞数的
平均数乘以１０４所得数即为ｌｍｌ悬液中含有的细胞数（数细胞的原则是数上不数下，数左不数右）。

３）细胞冻存：①选择正处于生长期的细胞。

②按传代中讲述的方法将细胞悬起，２００９Ｘ５ｍｉｎ离心沉淀细胞，弃上清。

③用细胞ｉ：６ｉ存液ｌｍｌ将细胞悬起，分装于两只细胞冻存管，并标明冻存细胞名称，冻存时间及冻存者，立即冰浴。

④先将细胞冰浴１ｈ；再转移至－２０。

Ｃ冰箱中８ｈ；最后将细胞转移至．８０。

Ｃ冰箱或液氮中保存。

４）细胞的复苏：①取出冻存的细胞（注意液氮中冻存管如封闭不严导致液氮注入，取出后可能会爆炸！），置于冰上，３７。

Ｃ１—２ｍｊｎ解冻。

②将融化后的冻存细胞转移到１０ｍｌ离心管中，然后再滴加５一ｌＯｍｌＤＭＥＭ完全培养基。

（重）２００９×５ｍｉｎ离心，以去除冻存液中的ＤＭＳＯ。

④去上清，加入７—１０ｍｌＤＭＥＭ完全培养基，将细胞轻柔的吹散开，转移到细胞培养瓶中，３７。

ＣＣ０２培养箱中培养。

１．３．８脂质体中介的细胞转染（以２４孔细胞培养板为例）：
１）贴壁细胞：转染前一天，每孔接种Ｏ．５—２．０×１０５个细胞在ｌｍｌ无抗生素ＤＭＥＭ培养基中。

悬浮细胞：转染时，每空接种４—８Ｘ１０５个细胞在ｌｍｌ无抗生素ＤＭＥＭ培养基中即可。

第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制螽、纯化及其检测
其余冻存于－８０℃。

１．３．２３免疫印记（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）：
１】选择合适胶浓度的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，上样，并同时加入蛋白质预染分子标准（或叫作彩虹Ｍａｒｋｅｒ），跑电泳将总蛋白分离。

注：蛋白质预染分子标准有两种用途：①作为分子置标准；②作为指示转膜效果的标准．
本实验所使用的哺乳动物细胞总蛋白上样物均是通过以下程序制备；２４孔细胞培养扳中接种、转染细胞，４８ｈ后吸弃ＤＭＥＭ培养基．直接加入１×蛋白ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ裂解细胞，收集裂解液，沸水浴１０ｍｉｎ．其间可多次震荡，１２０００９Ｘ５ｍｉｎ离心后取上清上样。

２）待溴酚蓝跑到胶最低位置，将胶剥离玻璃板．并做好方向标记，将胶浸泡于、剪好的硝酸纤维薄膜（Ｏ．４５ｕｍ）和６片Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭ滤
纸（或２片ＢＩＯ－ＲＡＤＥｘｔｒａＴｈｉｃｋＢｌｏｔＰａｐｅｒ，本实验多使
用此种滤纸）浸泡于蚩白质转移缓冲液中，室温下温和摇
晃２０ｍｉｎ。

滓；滤纸应人于硝酸纤维薄膜，薄膜比胶稍人即ｂｒ。

３）按右图铺好蛋白质转移“ｓａｎｄｗｉｃｈ”装置，
从下向上依次为：Ｊ下电极一３张滤纸一薄膜一胶一３张滤纸一负电极。

铺时应成斜角逐渐将每层铺平。

以防止产生气泡，并且要用干净玻璃试管滚压赶除气泡。

注：矸ｉ要将电极、胶、薄膜方向再反。

并注意排除气泡。

４）接通电源，稳压１２—１５Ｖ，此时电流应应最终稳定在１．Ｏ—２．５ｍＡ问（或直接调至稳流），转移１—２ｈ，或更长时间。

注：电流太低会影响转移效果。

可能是缓冲渡不对或滤纸浸泡育问题。

应将干滤纸宜接浸泡于转移缓冲液中。

转移时间长短应根据目标蛋白太小决定，如果分子量丈可以适当延长转移时间或增大转移电压，分子量应减小转移时间和电压，以免小分子穿膜丢失．
５）封闭：电转结束后，将转移膜取下（此时可以通过预染Ｍａｒｋｅｒ显示转移效果），浸泡于５％脱脂奶粉ＴＢＳ溶液中，室温摇晃封闭ｌｈ（也可以封闭过夜），同时可以将胶进行考染，观察带型。

６）一抗反应：以合适的浓度，将一抗溶于５％的胎牛血清ＴＢＳ溶液中（或５％的脱脂奶粉ＴＢＳ溶液）；将膜在ＴＢＳ．Ｔ中摇晃漂洗四次，每次５ｒａｉｎ后，将膜转移到一抗稀释液中，室温摇晃１ｈ。

第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制备、纯化及其检测
温延伸温度与普通ＰＣＲ相同，只是退火温度使用梯度式降低方式。

一般从６５＊（２以２—３℃为一个梯度降到５５＂（２或更低，最低温度可根据个人实际情况决定。

２结果与分析
２．１ＧＧＮＢＰ２的原核表达质粒的构建：
实验中曾构建过ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴｂ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰ）、ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）等表达质粒，及在ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）表达质粒基础上缺失ＮｃｏＩ酶切片段后自身环化获得了ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）表达质粒，ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴｂ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰ）、ＰＲＯＥＸ·ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）均不表达在宿主菌ＢＬ２１中均不表达，只有ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）获得了高水平的表达。

①②③①②①②③
图２．Ｉ（Ｆｉ９２．１）图２．２（Ｆｉ９２．２）图２．３（Ｆｉｇ２．３）
圈２．１ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴｂ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰ）Ｈｉｎｄ１１１酶切鉴定：①ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；②酶切质粒：
③未酶切质粒对照。

图２．２ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）克隆ＰＣＲ鉴定，扩增出近１０００ｂｐ
条带。

图２．３ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）克隆ＰＣＲ鉴定：②ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴＭＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）扩增产物：（要）ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）扩增产物对照。

Ｆｉｇ２．１ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＰＲＯＥＸ－ＨＴｂ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰ）ｗｉｔｈｔｈｅｄｉｇｅｓｔｏｆＨｉｎｄＩＩＩ：①ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：②ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔａｔｔｅｒｂｅｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄ③ｎｅｇｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｆｉ９２．２ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ．）ｗｉｔｈｃｌｏｎｅＰＣＲ；Ｆｉｇ２．３ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ｗｉｔｈｃｌｏｎｅＰＣＲ：⑦ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｎｏｆｃｌｏｎｅＰＣＲ；③ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｏｆｃｌｏｎｅＰＣＲｏｌｐＰＲＯＥＸ·ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＥＰＴ）．
０２１６８３９ＴＡＡ２２２３
图２。

４ＧＧＮＢＰ２表达片段示意图
Ｆｉｇ２．４ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＧＧＮＢＰ２ＺＦＰ加３（ＥＰ）一五ＦＰ印３ｔＥＰＴ）一
７．，１牛４０３（ＮＰ）＋
第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制备、纯化及其检测
２．２ＧＧＮＢＰ２的原核表达【表达产物命名为Ｈｉｓ—ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）将经鉴定正确的ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）转入ＢＬ２１大肠杆菌宿主菌，经ＩＰＴＧ诱导后，与未诱导转化菌对比，在预期分子量（约２２０个ＡＡ）位置出现明显
表达条带，且表达量较高（大于３０％），经表达蛋白大部分存在于包含体沉淀中，大量表达后分别以１．２Ｍ、２Ｍ、３Ｍ尿素梯度浓度ＴｒｉｔｏｎＸ．１００洗涤液洗涤包含体，获得很好的洗涤效果，表达蛋白约占最终总蛋白的９０％以上，但效果相差不大，最终选择３Ｍ尿素ＴｒｉｔｏｎＸ－１００洗涤液以获得大量更纯的包含体。

①②③①②③①②③④
图２．５图２．６图２．７
图２．５ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴ“ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）的原核表达鉴定：①蛋白质分子量标准；②未诱导全菌；③诱导表达全菌。

图２．６ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）表达形式的鉴定：②超声上清；③超声沉淀。

图２．７ｐＰＲＯＥＸ．ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）包含体尿素梯度浓度的洗涤：②１．２Ｍ；
③２Ｍ；④３Ｍ。

Ｆｉ９２．５ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐＰＲＯＥＸ—ＨＴ副ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ｉｎＥ．ｃｏｌｉ：（￡）ｐｒｏｔｅｉｎｌａｄｄｅｒ；ｔ熏）ｔｈｅｕｎｉｎｄｕｅｅｄｓａｍｐｌｅ；③ｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｓａｍｐｌｅｗｉｔｈＩＰＴＧ．Ｆｉ９２．６ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）：②ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔｅａｆＩｅｒｂｅｉｎ２ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ；③ｔｈｅｄｅｐｏｓｉｔａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｆｉ９２．７ｗａｓｉｎｇｏｆｔｈｅｐＰＲＯＥＸ－ＨＴ“ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｗｉｔｈｌａｄｄｅｒｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｕｒｅａ：②１．２Ｍ；③２Ｍ：④３Ｍ．
２１３免疫家兔获得抗血清
将洗涤后获得的包含体直接作为抗原，制备其４Ｍ尿素溶解液，与佐剂混合注射免疫新西兰大耳白兔，第二次加强免疫后１０天收集血清，以Ｍｙｃ－ＧＧＮＢＰ２ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞转染物为被检材料进行ＷＢ，与ＨＥＫ２９３ＦＴ非转染细胞裂解物对比，出现明显特异信号，但似乎存在着较强的非特异带。

箜三童鱼鱼型望丝耋塞堕垫签笪型鱼：丝丝垦基丝型一
①②
图２．８三次免疫后多抗血清的ＷＢ检测：①未转染ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞阴性对照：②ｐＣＭＶ－ｍｙｃ／ＧＧＮＢＰ２转染细胞。

Ｆｉ９２．８ａｓｓａｙｏｆｔｈｅａｎｔｉ—ｓｅｌⅥｍｔｏＧＧＮＢＰ２ａｆｔｅｒｔｈｅｒａｂｂｉｔｉｓｉｍｍｕｎｉｚｅｄｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ：①ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ：ｕｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＨＥＫ２９３ＦＴｃｅｌｌｓ；蓬）ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｐＣＭＶ－ｍｙｃ／ＧＧＮＢＰ２．
２．４对ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）表达洗涤后包含体进一步纯化使用镍离子螯和柱对盐酸胍溶解后的Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）进一步纯化，收集到的纯化产物经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测后，达到制备抗原亲和柱的要求。

图２．９图２．１０
图２．９Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）包含体镍离子螯和纯化洗脱峰；图２．１０Ｈｉｓ—ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）包含体镍离子螯和纯化蛋白ＳＤＳ—ＰＡＧＥ。

Ｆ１９２．９ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｓ－ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｗｉｔｈＮＴＡ—ｃｏｌｕｍｎ．Ｆｉ９２．１０ＳＤＳｏｔｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＨｉｓ－ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ｍｃＭｓ沁ｎｂｏｄｙ．
２．５制备Ｈｉｓ—ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）抗原亲和柱，从Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）兔多抗血清中纯化ＧＧＮＢＰ２相应抗体
以镍离子螯和柱层析纯化后的Ｈｉｓ—ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）作为抗原，制备了Ｈｉｓ－ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）抗原亲和柱，然后用Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）抗原亲和柱从Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）
兔多抗血清中纯化了ＧＧＮＢＰ２多抗，并得到了较为集中的抗体洗脱，超滤浓缩后测
的浓度为２．５ｕ＃ｕｌ。

３０
第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制备、纯化及基检测
图２．１１Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）兔多抗血清进样及洗脱杂峰
Ｆｉ９２．１１ｌｏａｄｉｎｇａｎｄｗａｓｈｉｎｇｗｈｅｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇＨｉｓ－ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ａｎｔｉ－ｓｅｒｕｍ｛８
Ｌ尘二二
图２．１２Ｈｉｓ．ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）兔多抗血清纯化抗体洗脱峰
Ｆｉ９２．１２ｅｌｕｔｉｏｎｗｈｅｎ
ｐｕｒｉｆｙｉｎｇＨｉｓ—ＧＧＮＢＰ２（ＮＰ）ａｎｔｉ·ｓｅｒｕｍ
２．６纯化后ＧＧＮＢＰ２多抗的质量检测
经ＳＤＳ—Ｒ蝤Ｅ显示纯化去除了血清中的一些杂蛋白，并获得了明显的重链轻链带；使用纯化后抗体对ＰＥＧＦＰ．Ｃ２／ＧＧＮＢＰ２转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行免疫染色，通过对比观察ＥＧＦＰ的绿色荧光和ＴＲ标记的抗兔二抗的红色荧光，两种荧光获得较好的重叠，表明纯化后抗体对ＧＧＮＢＰ２的识别性及特异性；以ＧＧＮＢＰ２细胞转染物作为被检材料进行ＷＢ通过与未转染细胞裂解物及商品化的Ａｎｔｉ．Ｍｙｅ单抗对照，结果同样显示获得了较好的特异性。

注意：ＧＧＮＢＰ２分子量比实际大了很多，详述见第三部分。

图２．１３
３Ｉ
第二章ＧＧＮＢＰ２多克隆抗体的制备、纯化及其检测
图２．１３细胞免疫检测ＧＧＮＢＰ２纯化多抗：①ＥＧＦＰ激发荧光；②ＴＲ激发荧光；⑤荧光重叠。

Ｆｉ９２．１３ａｓｓａｙｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ．ａｎｔｉｂｏｄｙ：①ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＥＧＦＰ；②ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＴＲ；（孰ｎｅｒｇｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔｗｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，
图２．１４图２．１５
图２．１４ＧＧＮＢＰ２纯化多抗ＳＤＳ．ＰＡＧＥ；图２．１５ＷＢ检测ＧＧＮＢＰ２纯化后抗体。

Ｆｉ９２．１４ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ—ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｆｉ醴．１５ａｓｓａｙｏｆｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ—ａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈ
ＷＢ．
３讨论
由于ＧＧＮＢＰ２是新发现基因，现在市场上还没有其可获得抗体，所以为了进一步研究它们在体内的特征，我们需要制各它们的抗体。

同时由于ＧＧＮＢＰ２分子过大，有７６１个氢基酸，这样的蛋白表达起来困难，而且抗原片段过大可能与其他不相干蛋白产生更多的免疫交反应，所以我们只选取了其中的一段进行表达，实验中发现ＧＧＮＢＰ２中有一段ＤＮＡ在大肠杆菌中表达量很低或者根本不表达，同时会抑制与之相连的其他片段的表达，缺失后，剩余片段才得以表达。

通过１｜｜ｆＢ和细胞免疫染色检测，最终结果表明我们制备了特异性较高的ＧＧＮＢＰ２纯化多抗，他将被应用于以后的研究工作中。

在实验中，我们摸索出了一套可以大批量、快速制备高质量多抗的实验方法，它包括抗原表达、抗原纯化、动物免疫、抗原亲和柱制备、抗体亲和层析纯化、抗体组织干粉吸附特异化以及最终抗体船和免疫染色检测等一系列步骤，这就为以后新基因的研究工作建立了一套快速获得其相应抗体的方法。

笙三童Ｑ鱼塑！堑鱼塑！查塞堕垫堡盟型量：丝丝墨基鳖型——第三章ＧＧＮｌ／ＧＧＮ３多克隆抗体的制备、纯化及其检测
ｌ实验材料、器材与方法
１．１实验材料
除增加使用了原核表达载体ＰＧＥＸ－４Ｔ１外，其余材料均与第二章相同。

１．２实验仪器
均同第二章。

１．３实验方法
均同第二章。

２结果与分析
２．１ＧＧＮ３的原核表达质粒
表达质粒有ＰＧＥＸ一４Ｔ１／ＧＧＮ３和ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮ３两种，均为本实验室保存质粒。

２．２ＰＧＥＸ．４Ｔ１／ＧＧＮ３的原核表达（表达产物命名为ＧｓＴ－ＧＧＮ３）将ＰＧＥＸ一４ＴＩ／ＧＧＮ３转入宿主菌ＢＬ２１，经ＩＰＴＧ诱导后，与未诱导转化菌和ＰＧＥＸ－４ＴＩ空载体诱导转化菌对比，在预期分子量（约４００个ＡＡ）位置出现明显表达条带，且表达量较高（大于５０％），经表达蛋白大部分存在于包含体沉淀中，大量表达后分别以１．２Ｍ、２Ｍ、３Ｍ尿素梯度浓度ＴｒｉｔｏｎＸ．１００洗涤液洗涤包含体，３Ｍ尿素浓度洗涤效果更好～些，表达蛋白ＧＳＴ－ＧＧＮ３约占最终总蛋白的７０％以上。

①②③④①②③①②⑨
图３．１图３．２图３．３
第三章ＧＧＮＩ／ＧＧＮ３多克隆抗体的制备、纯化及其检测
图３．ＩＧＳＴ－ＧＧＮ３表达鉴定：①蛋白质标准：②ｐＧＥＸ－４ＴＩ空质粒转化诱导表达全菌：③末诱导全菌；④诱导表达全菌。

图３．２ＧＳＴ∞ＧＮ３表达形式鉴定：②上清；③沉淀。

图３ｆ３ＧＳＴ－ＧＧＮ３包含体梯度尿素浓度洗涤：①１，２Ｍ；②２Ｍ；⑧３Ｍ。

Ｆｉ２３．１ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯＳＴ＿ＧＧＮ３：①ｐｒｏｔｅｉｎｌａｄｄｅｒ；②ＧＳＴ；③ｕｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；④ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈＩＰＴＧＦｉ９３．２ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｏｆＧＳＴ－ＧＧＮ３：②ｓｕｐｅｍａｔｅ；③ｄｅｐｏｓｉｔ．Ｆｉ９３．３ｗａｓｈｉｎｇｏｆＧＳＴ．ＧＧＮ３ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｗｉｔｈｌａｄｄｅｒｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｕｒｅａ：①１．２Ｍ；②２Ｍ；③３Ｍ．
２．３免疫家兔获得抗血清
将洗涤后获得的ＧＳＴ－ＧＧＮ３包含体直接作为抗原，制备其４Ｍ尿素溶解液，与佐剂混合注射免疫新西兰大耳白兔，第二次加强免疫后１０天收集血清，以ＨＡ．ＧＧＮ３ＨＥＫ２９３ＦＴ细胞转染物为被检材料进行ＷＢ，与ＨＥＫ２９３ＦＴ非转染细胞裂解物对比，出现明显特异信号，但存在着一定较强的非特异带。

①②
幽３，４
图３．４三次免疫后多抗血清的ＷＢ检测：①来转染细胞：（玉ｐＣＭＶ－ＨＡ／ＧＧＮ３转染细胞。

Ｆｉ９３．４ａｓｓａｙｏｆＧＧＮＩ／ＧＧＮ３ａｎｔｉ－ｓｅｒｕｍｗｉｔｈＷＢａｆｔｅｒｔｈｅｒａｂｂｉｔｉｓｉｍｍｕｎｉｚｅｄ３ｔｉｍｅｓ：①ｕｎ－ｔａｎｓｆｅｃｔｅｄ２９３ＦＴｃｅｌｌｓ；（窑）ｔｒａｎｓｆｅｘｔｅｄｃｅｌｌｓｗｉｔｈｐＣＭＶ－ＨＡ／ＧＧＮ３．
２．４ｐＰＲＯＥＸ—ＨＴａ／ＧＧＮ３的原核表达（表达产物命名为Ｈｉｓ．ＧＧＮ３）将ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮ３转入宿主菌ＢＬ２１。

经ＩＰＴＧ诱导后，与未诱导转化菌对比，诱导过夜后，在预期分子量（约１５０个ＡＡ）位置出现明显表达条带，经鉴定表达蛋白大部分存在于包含体沉淀中。

①②③④⑤⑥
图３．５
３４
图３．５ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮ３的藤核表达及表达物形式的鉴定ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：①蛋白质分子量标准；＠④未诱导全蔼；③诱导全菌；＠诱导表达菌超声沉淀｛＠诱导表达菌超声上清·
ｉｎＥ．ｃｏｌｉ：（￡）ｐｒｏｔｅｍＦｉ９３．５ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｏｆｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＣＫ３Ｎ３
ｌａｄｄｅｒ；②④ｕｎ．ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；（蚕）ｉｎｄｕｃｃｄｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈＩＰＴＧ；馒）ｄｅｐｏｓｉｔａｆｔｅｒｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄ
ｂａｃｔｅｒｉａａｒｅｃｒｕｓｈｅｄｗｉｔｈｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ；＠ｓｕｐｅｒｎ砒ｅ．
２．５使用镍离子螯和柱对Ｈｉｓ．ＧＧＮ３包含体直接纯化
将经过诱导过夜表达的ｐＰＲＯＥＸ－ＨＴａ／ＧＧＮ３ＢＬ２１转化菌超声破碎后，收集包含体，用ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（含６Ｍ盐酸胍）溶解后，直接用镍离子螯和柱进行螯合纯化，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ显示纯化效果可以，并同时用梯度浓度牛血清自蛋白对比估铡其蛋白浓度约为ｌｍｇ／ｍｌ。

一气
＿。

ｆ。

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～一ｕ·～…
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图３．６图３．７
图３．６镍离子螯和柱纯化Ｈｉｓ－ＧＧＮ３包含体洗脱峰。

图３．７Ｈｉｓ－ＧＧＮ３包含体纯化物及梯
度浓度ＢＳＡＳＤＳ·ＰＡＧＥ：①蛋白质分子量标准；（萤Ｈｉｓ－ＧＧＮ３纯化物；（蚕）４ｍｇ／ｍｌＢＳＡ；④
２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ＝⑤ｌｍｇ／ｍｌＢＳＡ。

Ｆｉ９３．６ｅｌｕｔｉｏｎｗｈｅｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇＨｉｓ，ＧＧＮ３ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ、ⅣｉｔｌｌＮＴＡ－ｃｏｌｕｍｎ．Ｆｉ９３．７
ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＨｉｓ－ＧＧＮ３ａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈＢＳＡ．
２．６制备Ｈｉｓ－ＧＧＮ３抗原亲和柱，从Ｈｉｓ—ＧＧＮ３兔多抗血清中纯化ＧＧＮＩ，ＧＧＮ３相应抗体
以镍离子螯和柱层析纯化后Ｈｉｓ．ＧＧＮ３作为抗原，制备了Ｈｉｓ．ＺＧＧＮ３抗原亲和柱，然后用Ｈｉｓ－ＧＧＮ３抗原亲和柱从Ｈｉｓ－ＧＧＮ３兔多抗血清中纯化了ＧＧＮｌ／ＧＧＮ３多抗，并得到了非常集中的抗体洗脱峰。

星三童鱼鱼邕！盟鱼堕！墨塞堕垫堡丝型鱼：丝丝垦基建型一一
圈３．８ＧＳＴ－ＧＧＮ３兔多抗血清进样及洗脱杂峰
Ｆｉ９３．８ｌｏａｄｉｎｇａｎｄｗａｓｈｉｎｇｗｈｅｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇＧＳＴ－ＧＧＮ３ａｎｔｉ－ｓｅｒｕｍ
幽３．９ＧＳＴ－ＧＧＮ３兔多抗血清纯化抗体洗脱峰Ｆｉ９３．９ｅｌｕｔｉｏｎｗｈｅｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇＧＳＴ－ＧＧＮ３ａｎｔｉ—ｓｅｒｕｍ
２．７纯化后ＧＧＮ３／ＧＧＮｌ多抗的质量检测
经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ显示，与未纯化血清对比，纯化去除了血清中的～些杂蛋白，并获得了明显的重链轻链带：同时为了进～步提高抗体质量，我们还使用了丙酮组织干粉对纯化后抗体进一步进行吸附，使用纯化吸附后抗体对ＰＥＧＦＰ．Ｎ２／ＧＧＮｌ和ＰＥＧＦＰ．Ｎ２／ＧＧＮ３转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行免疫染色，通过对比观察ＥＧＦＰ的绿色荧光和ＴＲ标记的抗兔二抗的红色荧光，两种荧光获得较好的重叠，表明纯化吸附后抗体对ＧＧＮＢＰ２的识别性及特异性：以ＧＧＮｌ和ＧＧＮ３细胞转染物作为被检材料进行ＷＢ通过与未转染细胞裂解物及商品化的Ａｎｔｉ．Ｍｙｃ单抗对照，结果同样显示获得了较好的特异性。

注意：ＧＧＮＩ蛋白盆子量比实医也太工很多，详述见第三部分。

图３．１０
３６
二
三。

三
一史一
第三章ＧＧＮＩ／ＧＧＮ３多克隆抗体的剑餐！丝些垦墓捡型
图３．１０细胞免疫检测ＧＧＮＩ／ＧＧＮ３纯化多抗：ＯＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮ３荧光；②ＴＲ荧光｛③荧光重合：④ＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ荧光：⑤ＴＲ荧光；⑥荧光重舍ｔ
ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＧＧＮＩ／ＧＧＮ３ｍｕｌｔｉ－ａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈｃｅｌｌｉｍｍｕｎｉｔｙＦｉ９３，１３ａｓｓａｙｏｆ
ｓｔａｉｎｉｎｇ：①ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮ３；②ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＴＲｏｆＧＧＮ３；③
ｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔｗｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＧＯＮ３．④ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ；⑤
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＴＲｏｆＧＧＮｌ；⑥ｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔｗｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆＧＧＮｌ．
图３．ＩＩ图３．１２图３．１３
图３．｝１纯化后ＧＧＮＢＰ２抗体ＳＤＳ，ＰＡＧＥ：①蛋白质分子量标准：②纯化后抗体；③未纯化抗血清。

图３．１２ＷＢ检测纯化后ＧＧＮＢＰ２抗体：①ＨＡ／ＧＧＮ３裂解物：＠２９３细胞空白阴性对照。

图３．１３ｗＢ检测纯化吸附后ＧＧＮＢＰ２抗体。

Ｆｉｇ３．１１ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ－ａｎｔｉｂｏｄｙ：①ｐｒｏｔｅｉｎｌａｄｄｅｒ；②ｐｕｒｉｆｉｅｄｍｕｌｔｉ—ａｎｔｉｂｏｄｙ；③ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉ－ｓｅｒｕｍ．Ｆｉ９３．１２ａｓｓａｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ·ａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈＷＢ：
①ｔａｎｓｆｅｃｔｅｄ２９３ＦＴｃｅｌｌｓｗｉｔｈＨＡ／ＧＧＮ３；（§）ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ：ｕｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ２９３ＦＴｃｅｌｌｓ．Ｆｉ９３．１３
ａｓｓａｙｏｆＧＧＮＢＰ２ｍｕｌｔｉ－ａｎｔｉｂｏｄｙｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄａｂｓｏｒｂｅｄｗｉｔｈｌｉｖｅｒｐｏｗｄｅｒ．
３讨论
同样由于ＧＧＮｌ／ＧＧＮ３也是新近发现的基因，现在市场上还没有其可获得商业化的
抗体，所以为了进一步研究它们在体内的特征，我们需要制备它们的抗体。

由于Ｃ－ＧＮ３
是ＧＧＮ！Ｃ末端的１３７个氨基酸“１，所以我们表达制备了ＧＧＮ３的多抗，它可以识别ＧＧＮｌ、
ＧＧＮ３两种蛋白，实验中我们可以根据两种蛋白在细胞中的定位不同而加以区别，它们
的抗体我们称作ＧＧＮｌ／ＧＧＮ３多抗。

以第二章同样的方法检测制各的抗体，最终结果表明我们制备了质量较高的
ＧＧＮｌ／ＧＧＮ３多抗，他将被应用于以后的研究工作中。

釜堕熏２兰鱼！！型！堑鱼塑！整塞室姿兰旦竺塑堕墨盟建宴
注：可根据表达蛋白特性进行鉴定，如根据蛋白带有的自发荧光标记肚。

对鉴定扳中细胞进行细胞免疫染色或表达蛋白的酶活性等来鉴定所需克隆。

５）待保种板中细胞长满后，将目的克隆转移到２４孔板，最后扩增到细胞培养瓶中，观察其稳定表达情况，并冷冻保种。

质粒的小量提取、ＤＮＡ片段胶回收、化学转化法大肠杆菌感受态的制备、大肠杆菌化学转化、细胞转染用质粒的小量提取、细胞转染用质粒的中取、细胞培养基本操作、脂质体中介的细胞转染、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ等方法详见第二章。

２结果与分析
２．１ＥＧＦＰ荧光显示筛选获得了较纯的ＧＧＮｌ稳定表达ＣＨＯ细胞系１４３Ｉ用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００转染５ｕｇｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ质粒到ＣＨＯ细胞中，２４ｈ后观察ＥＧＦＰ荧光，显示转染成功，将转染细胞消化，按１／１０比例稀释传代，并施加６００ｕｇ／ｍｌ的Ｇ４１８选择压力，加压３周后，发现产生大量Ｇ４１８抗性细胞．但只有很少一部分细胞能发荧光，而且根据荧光在细胞内的分布显示一部分细胞（荧光弥散于整个细胞）并没有正确表达ｐＥＧＦＰ．Ｎ２／ＧＧＮｌ，实验中也观察到表达ｐＥＧＦｐｏＮ２／ＧＧＮｌ的细胞（根据荧光在细胞内的分布断定）与只具有Ｇ４１８抗性的细胞相比生长明显慢得很多（约有ｌ一２倍的差别），我们又根据荧光挑取正确表达ｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮＩ的细胞，并进行稀释（１－２个细胞／２００ｕ１），然后按２００ｕ１／孑Ｌ的量接种于９６孑Ｌ板中，通过观察荧光显示获得了较纯的ＤＥＧＦＰ．Ｎ２／ＧＧＮｌ的稳定表达细胞。

翻４．１
图４．１ｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ稳定表达ＣＨＯ细胞ＥＧＦＰ荧光观察：①挑取单克隆激发荧光一
②挑取单克隆可见光观察：③极限稀释后细胞荧光；④更大放大倍数观察细胞荧光。

Ｆｉ９４．１ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ：（ｉ）ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｃｌｏｎｅ；（窑）ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｃｌｏｎｅｉｎｔｈｅｖｉｓｉｂｌｅｌｉｇｈｔ；③ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒａｌｏｎｇｅｒｔｉｍｅ；④ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
３９
箜婴童Ｅ曼Ｑ登型！箜鱼婪！整室室鲨曼坚Ｑ塑照墨丝堡塞一一２．２ＷＢ确定ＥＧＦＰ／ＧＧＮｌ融合蛋白在筛选细胞内的正确表达
ＧＧＮＩ／Ｃ“］Ｎ３纯化吸附后抗体，对筛选获得的ｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ稳定表达ｃＨＯ
细胞株进行ＷＢ检测，与空白ＣＨＯ细胞裂解物对照显示，所获得的细胞株正为
ｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌ稳定表达细胞。

圈４．２
图４．２Ａｍｉ．ＧＧＮｌ．ＷＢ检测ＥＧＦＰ／ＧＧＮｌ稳定表达细胞：０）ＣｌｉＯ空白细胞：（窑）ＥＧＦＰ／ＧＧＮｌ稳定表达ＣＨＯ细胞。

Ｆｉ９４．２ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｓｔｒａｉｎｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｐＥＧＦＰ－Ｎ２／ＧＧＮｌｗｉｔｈＡｎｔｉ－ＧＧＮｌ．ｗＢ：①ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ｕｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓ；②ｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｔｒａｉｎ．
３讨论
研究发现Ｇｇｎ基因是一种生殖系统特异表达蛋白。

在成年小鼠睾丸中，它的表达会随着生殖细胞发育阶段的不同而出现变化，在初级精母细胞粗线期后期开始表达并且表达量逐渐增高，在初级精母细胞双线期和次级精母细胞期表达量达到最高水平，
在精细胞期表达逐渐下降直至完全不表达。

在出生后小鼠睾丸发育过程中Ｇｇｎ基因的表达也表现出同样的时相，出生后１４天小鼠睾丸中Ｇｇｎ仍不表达，此时大部分生殖细胞处于初级精母细胞粗线早期，而２ｌ天小鼠睾丸中Ｇｇｎ开始表达，此时生殖细胞进入初级精母细胞粗线后期“３。

这些都说明Ｇｇｎ是一个与生精过程紧密相关的基因，
由于当前还没有一种可以供体外研究的生殖细胞系可以利用，所以我们期望能构建一种稳定表达Ｇｇｎ基因的细胞株。

另外，在生殖系统中，许多基因的ｍＲＮＡ前体都有多种不同的剪接方式，Ｇｇｎ就属于这类基因，它对应大约５ｋｂ基因组ＤＮＡ，ｍＲＮＡ前体有１０种不同的剪接方式，可最终翻译产生３种蛋白：ＧＧＮｌ、ＧＧＮ２和ＧＧＮ３。

其中ＧＧＮｌ、ＧＧＮ３可以与ＦＡＮＣＬ相互作用，ＧＧＮｌ、ＧＧＮ２可以与ＧＧＮＢＰＩ相互作用嘲，我们后来的研究还发现ＧＧＮｌ、ＧＧＮ３也可以与ＧＧＮＢＰ２、０ＡＺ３相互作用，可以看出在蛋白质相互作用中，ＧＧＮｌ处于一个中
４０。