新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的建立与评价

摘要：目的研究坏死性小肠结肠炎（NEC ）大鼠模型的简易制作方法。

方法3日龄SD 大鼠30只，雌雄不限，随机分2组（每组15只），即正常对照组与NEC 模型组，采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法造模，成功后取肠管组织，HE 染色光镜下观察并行Shiou 评分，Elisa 法检测炎性因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的水平。

结果NEC 模型组实验中死亡1只，对照组无死亡；与正常对照组相比，NEC 模型组HE 染色光镜下可见炎症反应明显，病理学检测Shiou 评分明显增高（P <0.01）；Elisa 法检测炎性因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）含量明显升高，差异有统计学意义（P <0.01）。

结论肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法能成功建立NEC 大鼠模型，且建模可重复性好，成功率高。

关键词：坏死性小肠结肠炎；Shiou 评分；炎性因子；大鼠中图分类号：R725.7
文献标识码：A
文章编号：1671-3699（2018）03-0083-04
DOI ：10.3969/j.issn.1671-3699.2018.03.018
新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的建立与评价
李小兵1，梁淑霞1，赖盼建1，徐洁1，包云光1，丁明星2，方远书3
（1.金华市中心医院，浙江金华321000；2.金华职业技术学院，浙江金华321007；3.金华市实验动物中心，浙江金华321000）
坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis ，NEC ）为新生儿常见胃肠道急诊，与NEC 相关的病死率高达20%～30%[1]，常见诱因如早产、肠内喂养和感染等目前已确定，但其发病机制的不确定，临
床仍然缺乏明确而有效的治疗策略[2]，还缺乏早期手术干预控制病程的足够证据，NEC 早期监测与预防极为关键[3]。

因而需要建立NEC 的可靠动物模型进行深入研究，而目前常见的建模方法均存在一定的不足。

本实验造模采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法，旨在建立一种从症状表现、病理生理与生化指标等方面都与人类NEC 类似，且简便易行，可重复性好的动物模型。

1材料与方法
1.1实验动物与造模方法
SD （Sprague Dawley ）大鼠雌雄不限，购自上海
斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK
（沪）2012—0002，合格证号：0278317。

30只出生3
天的实验新生大鼠分2组[4，5]
：①正常对照组，离开母
鼠后常规喂养，不给予任何干预与刺激；②NEC 模型组，离开母鼠后，采用肠内配方奶（PetAg 小动物
通用配方奶粉，美国PetAg 公司生产，批号H3564L ）喂养、缺氧-高氧暴露和冷应激的方法，即新生大鼠在灌气鼠笼中使用100%CO 2持续充气环境中5min ，然后保持97%O 2环境中5min ，每天两次，连续3天，并加腹膜腔注射生理盐水。

第7天，杀死大
鼠，取胃肠道组织（十二指肠末端至回盲部肠管）行组织病理学检测。

1.2大鼠肠道组织HE 染色病理学检测
主要试剂：二甲苯（成都市科龙化工试剂厂），伊红（上海迈坤化工有限公司，批号：20120831），苏木精（SIGMA ，批号：041M0014V ）。

主要仪器：轮转式切片机（RM2235型，LEICA 公司），病理组织漂烘仪（tec 2500型，常州市郝思琳仪器设备有限公司），显微镜（BX43型，OLYMPUS 公司），隔水式恒温培养箱（PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司）。

实验步骤：肠管组织石蜡切片，常规HE 染色后镜检。

1.3Elisa 法检测炎症因子水平
主要试剂：TNF-αElisa 试剂盒（CSB-E11987r ），IL-1βElisa 试剂盒（货号：CSB-E08055r ），IL-6Elisa 试剂盒（货号：CSB-E04640r ）。

收稿日期：2017-08-10
基金项目：浙江省实验动物科技计划项目（2014C37024，2017C37116），金华市科学技术研究计划重点项目（2015-3-010）
作者简介：李小兵（1977-），男，浙江兰溪人，金华市中心医院主任医师，研究方向为小儿消化系统疾病；丁明星（1968-），男，浙江金华人，金华职业技术学院医学院教授，研究方向为胃肠病学及肿瘤学。

金华职业技术学院学报2018年
主要仪器：酶标仪（BIO-RAD Model680），洗板机（Mindray MW-12A），恒温箱（DHG-9140A型，扬州鸿都电子），高速离心机（Thermo ST16R）。

实验步骤：①试剂准备，使用前将所有试剂和样本平衡至室温，标准品配制。

②加样及孵育，加抗体及孵育，洗涤后加HRP及孵育，洗涤后加TMB 及孵育。

③终止反应并测定吸光度，计算结果。

标准品和样本的OD（optical density）值减去零标准的OD值，取两个复孔的均值；建立标准曲线和公式，根据所测OD值计算出各样本的浓度。

1.4统计学方法
采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以α＜0.05为显著性检验水准。

2结果
2.1大鼠一般情况变化
NEC模型组大鼠综合应激刺激3天后出现活动减少，食奶减少，腹胀、腹泻，精神萎靡，体重下降。

其中1只只因拒食乳而逐渐衰竭死亡；对照组无异常，生长发育良好，体重稳定增长，进食及排便正常。

2.2大鼠肠道组织HE染色病理学检测
两组别大鼠肠道组织HE染色（hematoxylin-eo⁃sin staining）在光镜下可见，如图1所示。

正常组：肠黏膜上皮完整、连续，细胞与腺体排列规则，黏膜及黏膜下层无炎症细胞浸润；NEC组：肠绒毛水肿，粘膜固有层及粘膜下层大量炎症细胞浸润（以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主），肠腔毛细血管充血，甚至可见肠上皮坏死。

肠道病理组织采用Shiou等新的标准双盲法计分[6]，即0分：肠黏膜绒毛完整，组织结构正常；1分：轻微黏膜下和（或）固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿；3分：重度黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠坏死。

病理评分大于等于2分者视为NEC。

NEC模型组的评分显著大于正常组，差异有统计学意义（P＜
0.01），见表1。

2.3炎性因子含量比较
NEC模型组的炎性因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）含量均显著大于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

图1大鼠肠道组织HE染色光镜观察（HE,×200）
组别NEC模型组正常对照组
t/P SD大鼠/只
14
15
－
Shiou计分
4.34±0.82※
0.41±0.70
14.12/0.00
IL-1β
312.25±204.26※
54.48±34.40
4.82/0.00
检测指标
INF-α
42.72±18.46※
8.73±5.70
6.81/0.00
IL-6
2.29±0.90※
0.87±0.67
4.90/0.00
表1肠道病理组织Shiou计分及炎症因子水平比较
※与正常对照组比较，P<0.01
B NEC模型组A正常对照组
第3期
3讨论
本研究首先采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法建立NEC新生大鼠模型，并发现NEC大鼠的肠管组织Shiou评分及炎性因子（INF-α、IL-1β和IL-6）的水平均有升高，表现出其肠道有不同程度损伤。

NEC是最常见的新生儿胃肠道急诊，病死率较高。

具体机制未明，早产、肠道喂养及缺氧缺血等已被证实同NEC的发生密切相关，配方乳人工喂养更是其中的高危因素。

与母乳喂养相比，配方乳人工喂养能使NEC的发病率升高6～10倍，因为胃肠道中的粘液层的保护因素下降是关键环节。

本文的研究证实，NEC大鼠肠绒毛水肿、充血，甚至有肠上皮坏死与缺失，且NEC大鼠肠道病理组织Shiou 评分显著大于正常，显示其明显损伤及坏死，粘膜损失可能是一个独特的NEC的特点[7]。

有研究表明NEC肠粘膜损伤是由氧自由基介导下导致血小板活化因子（PFA）、白三烯和TNF-α等炎性介质释放作用的结果，炎症介质释放是NEC发生的最后的共同通路或关键环节[4]。

同样，研究发现，NEC模型组的炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量显著大于正常对照组，提示TNF-α、IL-1β、IL-6等参与NEC肠管细胞损伤和随后的细胞死亡过程，故治疗策略是否通过抑制炎症标志物和氧化应激的水平，从而有效地保护NEC诱导的回肠变性，尚需进一步确认。

目前，国内外有以下其它几种NEC建模方法[8-9]，一是缺氧-复氧，而临床上发现围生期窒息并不会引起NEC发病率的增高，用缺氧-复氧造模虽然简便，但很少出现典型的NEC症状及肠道病理变化。

二是缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R），主要是采用肠系膜上动脉结扎法，但单纯I/R后的早产鼠和足月新生大鼠并未出现腹胀、腹泻等症状，肠道上皮细胞及绒毛也均未见任何损伤，单纯的I/R对肠道的损伤往往是一过性的，较少导致典型的NEC。

三是注射各种炎性介质，炎症介质会造成内毒素血症，出现多器官广泛病变，且其病变好发部位与NEC患儿不同，常发生于空肠，结肠和直肠并不受累。

因而采用上述单一因素造模法其成功率较低，急需改良或综合。

自1974年Barlow等采用配方乳人工喂养、缺氧以及细菌接种成功建立新生大鼠NEC模型后，大部分学者都以此为基础运用早产+人工喂养+缺氧冷刺激来建模。

Lodha等[4]研究表明，综合采用人工喂养+缺氧的方法对3日龄大鼠进行造模，其NEC的发生率为56％，尽管该模型的成功率仍未达到研究预期，但较上述单因素模型有显著提高，它已用于
NEC肠道损伤的保护作用等研究[10-11]。

本次研究采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的的这种综合方法建立动物模型较为理想。

建模操作简便易行且成功率高，建模时间较短，可重复性好。

症状表现、病理生理和生化指标等都与人类NEC类似的动物模型，可广泛适用于NEC的转化研究。

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李小兵等：新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的建立与评价
金华职业技术学院学报
2018年
Establishment and Evaluation of Necrotizing Enterocolitis Models
in Neonatal Rats
LI Xiaobing 1,LIANG Shuxia 1,LAI Panjian 1,XU Jie 1,BAO Yunguang 1,DING Mingxing 2,FANGYuanshu 3
（1.Jinhua People ’s Hospital,Jinhua 321000,China ；2.Jinhua Polytechnic,Jinhua 321007,China ；
3.Jinhua Center of Laboratory Animals,Jinhua 321000,China ）Abstract ：Objective To study the simple method of making necrotic enterocolitis （NEC ）rat model.Methods Thirty three-day-old SD rats were randomly divided into 2groups （15in each group ）,namely the normal control group and the NEC model group.They were fed with enteral formula feeding,hypoxia and hyperoxia exposure and cold stimulation.After successful stress modeling,intestinal tissue was taken,HE-staining and light microscope was used to observe the sequential Shiou score.Elisa method was used to detect the levels of inflammatory factors （TNF-α,IL-1βand IL-6）.Results One death occurred in the NEC model group and no death occurred in the control pared with the normal control group,the inflammatory reaction was evident under the light microscope of the HE staining in the NEC model group,and the Shiou score in the pathological examination was significantly higher （P <0.01）.The levels of inflammatory factors （TNF-α,IL-1βand IL-6）were significantly increased,and the difference was statistically significant （P <0.01）.Conclusion The combined stress method of enteral formula feeding,hypoxia and hyperoxia exposure and cold stimulation can successfully establish the NEC rat model with good repeatability and high success rate.
Key words:necrotizing enterocolitis,shiou score,inflammatory factors,rats
责任编辑：傅美贞
408-412.
[9]ZHOU W,ZHENG X H,RONG X,et al.Establishment and evaluation of three necrotizing enterocolitis models inpremature rats [J].Molecular Medicine Reports ，2011，4（06）：1333-1338.
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