BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序
目的：
规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围：
本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者：
操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。

保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。

内容：
1.每日开机程序
1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：
1.1.1鞘液充满状态，约3L
1.1.2盖紧盖子
1.1.3安上金属挡板
1.1.4管路畅通，无扭曲
1.2.检查废液桶，确认：
1.2.1废液桶充满400ml漂白剂
1.2.2管路畅通，无扭曲
1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2.每日关机程序
2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。

2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。

2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。

2.6退出所有应用软件，关闭电脑。

2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3.每月维护程序
3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到
SANLINE FILTER 端口），以防伤害。

3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。

3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。

3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。

3.6以HI RUN 10-20 分钟。

3.7在测定正式样品之前实施每日开机程序。

4.FACScomp 自动质控操作
4.1试剂准备
4.1.1三色试剂的校正（Cat No ：340486 ）
4.1.1.1取四色试剂盒中的Unlabeled 试剂，充分混匀，加一滴到装有1ml 鞘液的试管中，混匀，标记为unlabeled 。

4.1.1.2取FITC、PE、PerCP、unlabeled 试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有2ml 的鞘液的试管中，混匀，标记为mixed 。

4.1.1.3上机进行仪器的校准。

4.1.2或四色试剂的校正（Cat No：340486；Cat No:340487 ）
4.121 取试剂盒中的unlabeled试剂和APC试剂各一滴加入到第一支装有1ml鞘液的试管中，混匀。

4.1.2.2取5种试剂（FITC、PE PerCP、APC Un labeled ）各一滴加入第二支装有2ml鞘液的试管中，混匀。

4.1.2.3上级进行仪器的校准。

4.2Calibrite beads FACScomp 上机操作的具体步骤
4.2.1执行FACSalibur 开机程序；
4.2.2执行FACScom歌件；
4.2.3在运行“ Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“ Acceppt ”；
4.2.4进入” Set Up窗口，先看最左侧的Assay selection 选项，在里面选中Lyse/Wash或Lyse/No Wash；
4.2.5在Calibrite Beads Lot IDS 中，根据每种颜色的beads 所对应的Lot ids ，输入编号，次编号在Calibrite Beads 试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背
面，标题是Calibrite Beads T%Batch NO，选择FACS Flow Sheath 下的编号（右侧的编号）；如做
四色校正，同样方法输入Calibrite Beads TM APC的IDS。

4.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径Facstation\BD file\FACSComp\DDMMYY还可以单
击“ Location ”改变保存路径；
4.2.7其他的不要改动，直接单击“ run”出现PMT视窗，然后准备好上样管；
4.2.8上第一管后单击start，仪器开始自动调节PMT完成后仪器会在窗口底部出现一行提示：
“ PMTs set Successfully ”，这时软件会暂停 5 秒，然后自动进入下一个调节窗口（Comp 窗口）；
如果是四色微球调试，仪器还会对激光的延迟进行测试，直到仪器电脑屏幕出现提示: “ Time Delay Calibratio n was successful "，然后才会同样自动进入下一个调节窗口（Comp窗口）；
4.2.9上第二管，单击start ，仪器开始自动调节补偿并进行灵敏度测试。

完成后仪器会给出提示，
最后软件给出一个Summary Report。

检查报告中的“ Result ”是否都PASS如果有没有PASS坚持原因。

（1）是否试剂过期（2）两个试管中的液体和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）
日常维护是否充分适当（5）联系BD人员
4.2.10打印报告，退出FACScom软件；
4.2.11计算机会自动把FACScom测试结果保存在Calib File或Calib File .LNW（免洗试验）中，运行其他程序，调用这些结果就可以进行样本的检测。

注意事项： 1 、第一管的速率不能低于400 个/ 秒（run high ），少于时可以补一滴Unlabeled 。

2 、两个试管中的鞘液必须和鞘液桶中的是同一种液体。

5.FACScomp校正HLA-B27的操作说明
5.1试剂的准备：
取HLA-B27 试剂盒的HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）试剂，混匀，加两滴到装有1ml 鞘液的试管中，混匀，待测。

5.2FACScomp 上机检测HLA-B27 的具体步骤
5.2.1执行FACSCalibur 开机程序；
5.2.2运行FACScomp软件；
5.2.3在出现“ Sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单机“ Accept ”；
5.2.4进入“ Set up ”窗口，先看最左侧的Assay selection 选项，选择HLA-B27 Assay ，在进行HLA-B27 Assay 之前，必须一次性的通过Lyse/Wash Assay 校正；
5.2.5在右侧框中输入正确的HLA-B27 Lot No值、Suffix 值和Beads Lot No 值。

这些参数分别决
定了FL1 PMT的标准和decision maker 的位置。

对于结果至关重要，不可弄错；
5.2.6在右侧的保存选项中文件会自动保存，路径日期，还可以单
击“ Location ”改变文件保存路径；其他的不需要改动，直接单击“run ”出现PMT视窗，然后准备
好上样；
5.2.7放上Beads管后单击start，仪器开始自动调节PMT完成后仪器会在底部出现一行提示：“PMTs set successfully ”这时软件会暂停 5 秒，调试后的结果会自动保存在Calib File.B27 中，并生成summary
Report ；
5.2.8退出FACScomp软件，然后进入HLA-B27软件进行检测。

6.MultiSET 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数
6.1实验原理：用已知总数的荧光微球Beads 做标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式
细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3 CD4 CD8 B、NK细胞的绝对数。

细胞（/ ul ）=（细胞获取数x Beads总量）/ （Beads获取数样本量）
6.2主要试剂：
6.2.1抗体：CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD16+56/CD45/CD19四色荧光抗体。

6.2.2Trucount 管（内含数量已知的Beads）。

6.2.3FACS Lysing Solution （溶血素）（ 1 0 x ,使用前用蒸馏水稀释成1x）
6.3实验步骤:
6.3.1取2支TruCount管，顺序编号A和B;
6.3.2用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血; 注意: 血不要碰到试管底部的微球（Beads）。

6.3.3取20ulCD3/CD8/CD45/CD4 抗体加入到 A 管中；取20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19 抗体加入到 B 管中。

注意：不要碰到血。

涡旋混匀，室温避光放置15-20min ；
634加入450ul 1 X FACS溶血素，充分混匀，室温避光放置15min ;
6.3.524 小时内上机，用MultiSET 软件获取15000个细胞进行检测，上机前应充分混匀。

6.4注意事项：
6.4.1样本使用EDTA抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。

6.4.2取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二挡，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。

6.4.3染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀，过程中尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。

6.4.4本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。

6.4.5TruCOUNT管2-25C保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT f包装袋密
闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOU NT管应弃去不要
7．MultiSET 软件收获分析的具体操作
7.1执行FACSCalibur 开机程序，进入MuliTSET 软件。

7.2在出现“sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、负责人姓名等信息，计算机将保存这些信息；
相关信息，单机“ Accept ”。

7.3进入“ set up ”窗口：
7.3.1在“ Data Source ”对话框中选择“ From Cytometer : Acquisition and Analysis ”；
7.3.2在“ Automatic Saving Options ”中选者“ Data File ”、“laboratory Report ”、“Physician Report ”，软甲会自动生成并保存报告文件，文件的默认路径Faacstation\BD file\Multiset\DDYYMM 文件夹；
7.4在“ View Report ”中选择“ Until ‘Next'Button Pressed ” .
7.5然后单击“ Accept ”，进入“ FACSCom p窗口，单击“ skip FACSCom p （四色仪器调整FACSComp 在检测前单独完成，见FACSCom操作部分）。

7.6进入“ Test Prefs ”窗口，在“ Physicians Report Choices ”一项可以全选，运行一种试剂，会自动报告相应的结果。

在“ Lot ID ”中输入TruCount 管批号和Beads 总数（标在包装袋上），单击“ Accept ”。

7.7进入“ Samples”窗口，在表格中输入相应的Patient Name、ID\Case Number和在Panel中选
择4color TBNK+Truc ；
7.8在窗口最上方“ Cytometer ”的下拉菜单中依次选择“ Detectors/Amps ”、“ Threshold ”、“Compensation ”、“Staus ”,出现相应的四个窗口；在“Cytometer 的下拉菜单中，单击“Instrument Setting ”，在出现的新对话框中单击“open ”；打开路径下Facstation\BD file\Instrument
Setting\Calibur.LNW 文件，调用仪器各个参数条件，最后单击“Open”“Set”“Done”。

7.9单击“ Run Test ”，上样，此时调整SSC电压和阈值，单击“ Acquire ”。

7.10获取完成后，可以打开屏幕底部的“Manual Gate”人工调整各个门的大小，单击“Continue ”，
进入医生报告窗口“ Phys Report ”，可打印。

7.11 继续其他实验，或单击“ Quit ” ,“Don't Save ” , 退出MultiTest 软件。

操作中特别注意第3-7 步，尤其是第7步。

注意: 做相对计数时，用普通的流式管代替TruCount 管，在Panel 中选择4colorTBNK 。

做三色绝对或相对计数时，只需改变Panel 即可。

8．CellQuest Pro 双色淋巴细胞亚群分析样本制备
8.1实验目的:使用双色组合标记抗体对人外周血中淋巴细胞亚群进行检测，了解认得免疫状态。

从而指导临床诊断和治疗。

8.2实验原理:利用荧光技术，在不同的鼠抗人的抗体上标记荧光素，此荧光抗体就同人淋巴细胞表面是CD分子特异性的结合；然后用流式细胞仪检测，结合分析软件的自动分析，便可以得出各亚
群细胞的百分比。

8.3主要试剂：
8.3.1流式细胞仪(FACSCalibur)，台式离心机，涡旋振荡器，微量移液器( 1000卩L、200卩L、20
卩L,流失细胞专业试管、鞘液；PBS(加0.1%叠氮钠);
832 双色检测试剂：① Isotype Control ( MouselgG/IgG 2a)(②CD3-FITC/CD19-PE③ CD3-FITC/CD4-PE ④
CD3FITC/CD8-PE⑤ CD3-FITC/CD16+CD56-PE
8.3.3FACS Lysi ng Solution 红细胞裂解液(10 x ,使用前用蒸馏水稀释成 1 x)o
8.3.41% 的多聚甲醛，配制方法:
称1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56C水浴箱中使之溶解，用1N NaOH溶液和1N的HCL调整PH值
在6.9-7.0，然后加入100ml容量瓶中定容，最后用0.45卩m的滤膜过滤。

8.4实验步骤：
8.4.1取5支流式试管，编号为1、2、3、4、5,分别取10卩L抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。

8.4.2轻轻混匀，依次加入20 卩L 双标Isotype Control ( MouselgG/IgG 2a)、CD3/CD19 CD3/CD4
CD3/CD8 CD3/CD16+CD5荧光抗体。

室温避光保存20分钟。

8.4.3取出试管，每管加入10倍稀释的1 x FACS Lysing Solution 2ml ，涡旋混匀，避光10分钟。

300g离心5min，弃去上清液。

8.4.4每管加入2ml的PBS涡旋混匀，300g离心5min,弃去上清液。

然后加入0.5mlPBS混匀，4 C 避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml 1%多聚甲醛，放4C冰箱保存，48h内上检测。

9.CELLQuest Pro 的简要操作步骤( 1)
Acquisition 获取数据
9.1打开获取模板(ACQ文件)，如无现成的模板则制作新模板：
9.1.1选择点图或直方图工具,在窗口拖出大小合适的方框,点击图形的边缘
9.1.2Windows-show Inspector , Inspector 窗口选择：
9.1.2.1Plot Type 点图类型：如Acquisition 获取
9.1.2.2X Parameter 横轴参数：如FSC;Y Parameter 纵轴参数：如SSC
9.1.2.3Gate 设门：如No Gate 或G1=R1
9.1.3图形设置完毕，选择SAVE AS,保存为ACQ文件
9.2联机Acquire 宀Connect to cytometer ，出现Acquisition control 禾口Browser 窗口，先将Browser 窗口最小化；
9.3数据获取前的设定：
9.3.1Acquire Acquisition & Storage-设定获取细胞数(10000-ALL) -OK
9.3.2打开最小化的-Browser 对话框选择：
-Directory :单机Change设定存储数据文件的文件夹；
-File 设定数据文件的名字：文件前缀(Prefix )-自定义；文件后缀(Suefix )-管号(设为1), 单机ok；
- 检测或设置panel ,确定试验组合；
如果没有相应的panel则设置新的panel : Acquire宀Edit panel ，在弹出的对话框单击add选项,在new panel 中输入新的panel 名称,然后单击前面的三角选中该panel 激活Tubes 窗口,单击add加试验管，编辑各试验管的P1, P2, P3, P4确定实验组合，单击ok;然后按照已有panel 操作；
已有panel 的在Un titled Acquire Tube List 下来菜单中选择Load Tubes From Pan el 宀选择
新编辑或实验对应的panel
9.3.3Acquire Counter 打开计算器。

9.4打开获取条件窗口,调出实验获取条件( Instrument Setting )
9.4.1Cytometer-Detectors/Voltage , Threshold , Compensation
9.4.2Cytometer-Instrument Setting-Open 打开实验获取条件（FACSStation-BD File- Instrument Setting Files-Calib file 或者Calib file.LNW ）Open-set-done
943实验获取条件的调整：Acquisition Control- V Setup-上样（第一管）-Acquire-进行实验获
取条件的调整：
①FSC SSC电压。

②FSC阈值（Threshold）：减少碎片。

③设门：FSC/SSC点图设门（R1）;荧光（FL）点图（如FL1/FL2 ）或直方图（如FL1）取门G仁R1（点击图形的边缘-Inspector-Gate ：G1=R1）。

④阴性对照管，调整荧光电压（FL1、FL2、FL3、FL4Voltage），使阴性群体在左下角，确定十字位
置。

⑤换地 2 管，多色实验的补偿管（单阳性），调整荧光间补偿（Compensation ）：
（ 1 ）Cytometer-Instrument Setting-Save 保存实验获取条件（InstrSet+ 实验获取名称）
-Done （此步骤为可选项）；File-Save保存模板ACQ文件（新作模板）。

（2）Acquisition-Counter ，打开计数器。

9.5顺序上样，获取数据文件：Acquisition Control- □ Setup-上样-Acquire-仪器获取足够细胞后，
自动保存数据文件（data file ），Quit- Don't save
10.CELLQuest Pro 的简要操作步骤（2）
10.1A nalysis 数据分析（新作模板ANA文件）
10.1.1做FSC/SSC点图，圈细胞R1
10.1.1.1选择点图工具，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘
10.1.1.2Windows-show Inspector ，Inspector 窗口选择：Analysis 分析；Select File 选择第一管数据文件；X Parameter 横轴参数-FSC;Y Parameter 纵轴参数-SSC；Gate 设门-No Gate
10.1.1.3选择设门工具-在FSC-SSC点图上，圈细胞R1
10.1.2做阴性对照管门内细胞的FL1/FL2 点图，设十字，区分阴性和阳性界限
10.1.2.1选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘
10.1.2.2Windows-show Inspector ，Inspector 窗口选择：Analysis 分析；Select File 选择阴性对照管数据文件；X Parameter 横轴参数-FL1;Y Parameter 纵轴参数-FL2；Gate 设门-G1=R1
10.1.2.3选择十字工具-在阴性对照管FL1/FL2 点图上，沿阴性群体设十字
10.1.3做各实验管门内细胞的FL1/FL2 点图，拷贝阴性对照管的十字
10.1.3.1选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，点击图形边缘
10.1.3.2Windows-show Inspector ，Inspector 窗口选择：Analysis 分析；Select File 选择实验管数据文件；X Parameter 横轴参数-FL1;Y Parameter 纵轴参数-FL2 ；Gate 设门-G1=R1
10.1.3.3店中阴性对照管FL1/FL2 点图上的十字=Edit-Copy- 点中试验管FL1/FL2 点图-Edit-Paste
10.1.4做各实验管FL1/FL2点图的十字统计：点中试实验管FL1/FL2点图-Stat-Quadrant Stat- 出现统计结果-点中统计结果框-Stat-Edit Quadrant Stat- 选择输出结果（如Percent of gated 门内细胞阳性百分率）。

10.1.5选择文字工具（A），在报告上添加文字说明，报告实验结果。

10.1.6Save As 保存分析模板（ANA文件）或分析结果，Print打印分析结果。

10.2An alysis 数据分析（已有模板ANA文件）
打开已保存的分析模板（ANA文件），依次改变各图要分析的数据文件（Edit-Select All-Plots-Change Data File ），在出现的窗口中按文件存储路径找到数据，选中第一关文件-open ；在空白处单击一下鼠标，选中第三个图标按｛苹果+ ]｝调出第二管文件；第四个图｛苹果+ ] ] ｝以此类推，调整圈细胞群的门R1的位置，调整十字门位置，根据统计结果更改报告中结果，打印分
析结果。

11.HLA-B27 分析和软件操作
11.1.1试剂：
11.1.1.1HLA-B27 试剂盒-包括抗体试剂A,10 X溶血素试剂B,微球试剂 C
11.1.1.2抗凝全血
11.1.1.3流式细胞实验常规试剂和仪器。

11.1.2制备流程：
11.1.2.1在试管上对应于每一个样本做好识别标志（每个样本一个试管）
11.1.2.2加30卩L抗体到试管中
11.1.2.3用微量移液器小心滴将50卩I充分混匀的康宁血加到进样管的底部，确保WBC勺浓度在3.5
33
X 10 -9.4 X 10 WBC❻L之间，低速混匀3秒钟，室温避光静置15-20分钟；
注意：小心避免血样加到试管壁上，一面血与试剂不能充分接触，静置时避免样本直接光照。

11.1.2.4将10X溶血素用蒸馏水稀释成1X,每管中加入2ml试问的1 X溶血素，立即低速混匀，
避光试问静置10分钟，不要超过12 分钟；
注意：溶血时间不应太长，以免破坏白细胞。

11.1.2.5随后室温300g离心5min
11.1.2.6弃去上清液，留大约50卩L液体于试管中以免损伤细胞团
11.1.2.7低速混匀，重悬细胞，每管中加入2ml含0.1%叠氮钠的PBS清洗细胞，低速混匀，室温
300g 离心5min
11.1.2.8吸去上清液，留大约50卩L液体于试管中以免损伤细胞团
11.1.2.9低速混匀，重悬细胞，每管中加入含1%-2%多聚甲醛的PBS来固定细胞，低速混匀，固定
30 分钟
11.1.2.10将已处理好的样本管盖好，避光保存于2-8C以待上机检测。

最好在染色后24小时以内
分析样本，上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。

11.2HLA-B27 自动软件上机检测的具体步骤
11.2.1执行FACSCalibur开机程序，进入HLA-B27软件。

11.2.2在出现的“sign in ”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，单击“ Accept ”，计算机将保存这些信息。

11.2.3进入"set up"窗口，首先在"Data Source ” 对话框中选择"From Cytometer "，并输入"15000”。

然后在：
A）“File name perfix ”中选择“ Patient name ”；
B）在"Automatic Saving Options ”中选择好"Data File ”、“ Laboratory Report ”，软件会自动生
成一个文件夹，文件的默认路径Facstation G5\BD files\HLA-B27\DDMMYY 文件夹；
C）单击“ Location ”可改变文件保存路径；在出现的新的对话框中指定的文件夹，选好文件夹后，单击对话框底部的“ chose ” （此步骤为可选项）。

D）在“ View Report ”中选择“ Un til ‘ Next' Button Pressed ”；最后单击“ Accept ”。

11.2.4进入“ FACSCon”窗口，在这里可以进入FACSCom软件，做HLA-B27 beads的调试。

如果
之前做了就单击“ Skip FACSComp”。

11.2.5进入“ Patients ”窗口，在表格中输入相应的Patient Name 、ID、Case Number。

11.2.6然后单击“ Rur”，单击“ Acquire ”。

不要调节仪器的设置，仪器会自动调出条件。

获取完成后打印Laboratory Report 。

11.2.7如果要继续检测单击“ More Tests ”，如果退出单击“ QUIT” -“Don' t save ”。

11.2.8退出软件，按每日关机程序清洗仪器，关机。

11.3或用Cellquest Pro/Cellquest 手动软件进行HLA-B27获取和分析
11.3.1打开获取模板（HLA-B27 ACQ文件）;
或制作新模板：
11.3.1.1选择点图或直方图工具，总共画三个图，两个散点图，一个直方图。

11.3.1.2散点图FSC/SSC 画出一个新的散点图后，在Windows-show Inspector , Inspector 窗口
选择： Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数： FSC ； Y Parameter 纵轴参数： SSC ； 选择
Multicolor gate 属性， Gate 设门：如 No Gate ；
11.3.1.3 散点图 FSC/CD3PE,画出一个新的散点图后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗 口选择： Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数： FSC ； Y Parameter 纵轴参数： CD3 PE;在图中画门 R1圈
上CD3+阳性的细胞；
11.3.1.4 直方图 HLA-B27 FITC/Counts ，画出一个新的直方图后，在 Windows-show Inspector ， Inspector 窗
口选择： Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 横轴参数： FITC, 选择门 G1=R1
选择Maker 工具，在直方图中画
M1,圈定所有细胞，选中这个直方图，对直方图进行统计
-His-Stats ，统计框中选择 File Name 、Maker label 、％Gate Mean 和 Median ;并且改 Plot 菜单 下的 Log dataUnit 属性为 Chanel ， Acquire 菜单下 Acquisition ＆ Storage 中的 Resolution 属性为 256。

11.3.1.5 设计试剂参数，在Acquire 菜单中选择 Paarameter Description ，在对话框中设定：P 仁FSC P2=SSC ， PS=HLA-B27 FITC ， P4=CD3 PE 。

11.3.1.6 图形设置完毕，选择 SAVE AS 保存为HLA-B27 ACQ 文件模板。

11.3.2 联机 Acquire-Connect to cytometer ，出现 Acquisition Control 窗口； 11.3.3 数据获取前的设定：
11.3.3.1 Acquire-Accquisition ＆Storage- 设定获取细胞数（ 10000-ALL ）-OK 11.3.3.2 Windows-Browser 对话框选择： -Directory 设定存储数据文件的文件夹； -File 设定数据文件的名字：文件前缀（ Prefix ）-自定义；文件后缀（ Surfix ）-管号；
11.3.4 打开获取条件窗口，调出实验获取条件（ Instrument Setting ）；
11.3.5 样本优化实验条件： Acquisition
（不能调节各荧光电压和补偿） ：
-调整FSC SSC 电压使细胞完全显示在 FSC/SSC 图上; - 调整FSC 阈值（Threshold ）：减少碎片;
-调整FSC/CD3 PE 中的R1,圈定需要分析的细胞（CD3+ ;
-调整HLA-B27/Counts 中的M1,圈定所有细胞。

（M1可以画的大一些） - 可以保存经样本优化过的实验条件： Cytometer-Instrument Setting-Save
（ InstrSet B27 ）-Done 。

11.3.6 顺序上样，获取数据文件： Acquisition Control- □Setup- 上样 -Acquire- 仪器获取足够细 胞后，自
动保存数据文件（ data file ）。

11.3.7调节FSC/CD3 PE 中R1的位置准确地圈定好需要分析的细胞；并同时调节
HLA-B27/Counts
中的M1,把所有细胞出现的峰全部圈住； His-Stats 统计表中统计出 B27的平均荧光，得出分析结
果。

11.3.8 输入相关信息，保存并打印统计结果，退出程序。

12.
DNA 测定
12.1 材料和试剂 12.1.1 抗凝外周血；
12.1.2DNA QC Particle ，DNA 测定质量控制试剂盒（ BD 公司，349523）CEN 小鸡红细胞核，
CTN
小牛胸腺细胞核，2卩m 的荧光微球，核酸染料
PI 。

12.1.3 C ycleTEST PLUS DNA ReagentKit 试剂A ,试剂B ,试剂C ,缓冲液
12.2 样本制备
11.3.4.1 Cytometer-Detectors/Voltage 11.3.4.2 Cytometer-Instrument Setting-open
下找到并选择 Calibur file.B27
， Threshold 。

，在 Facstation G5\BD
file\Instrument 文件， Open-Set-Down.
Control ? Setup- 上样 -Acquire- 进行实验获取条件的调整
保存实验获取条件
12.2.1质控样本的制备（DNA QC Particle ）
CEN:轻轻摇匀后，吸取40卩L到1mL PI中，混匀室温避光放置10分钟，即可上机。

CTN :大力震荡试剂瓶，吸取40卩L到1mL PI中，混匀室温避光放置10分钟即可上机检测。

1222 外周血DNA羊本的制备（Cycle TEST PLUS DNA Reage nt Kit ）
1222.1将100卩L抗凝外周血全加入17 100-mm 的管中
12.2.2.2加入1 的溶血素2ml，混匀，室温放置10分钟
12.2.2.3室温300 g 离心 5 分钟，吸去上清液
12.2.2.4加入2mlPBS洗涤细胞1次，室温300 g 离心5分钟，吸取上清液
12.2.2.5加入250卩L A液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟
12.2.2.6加入250卩L B液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟
12.2.2.7加入250卩L C液，轻轻混匀，不要震荡，低温（2~8C ）避光静置10分钟
12.2.2.8用50卩m尼龙网膜或35卩m细胞过滤器过滤细胞
12.2.2.9低温避光放置以待上机检测。

建议在加入C液后3小时内上机，上机前轻轻混匀细胞悬液。

12.3.Acquisition :用CellQuest/CellQuest Pro 软件获取数据
12.3.1打开获取模板（ACQ文件）或制作新模板：
图 1 :选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的点图对话框或Inspector 中，选择: Acquisition 获取；X Parameter 横轴参数：FSC Y Parameter 纵轴参数：SSC OK-出现相应的点
图。

图2：选择点图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的点图对话框或Inspector 中，选择：Acquisition 获取；X Parameter 横轴参数：FL2-W; Y Parameter 纵轴参数：FL2-A; OK-出现相应
的点图。

图3：选择直方图，在窗口拖出大小合适的方框，在出现的直方图对话框或Inspector 中，选择：Acquisition 获取；X Parameter横轴参数：FL2-A ; OK-出现相应的直方图。

在本图横轴200和400 的位置分别设M门，标为M1和M2对此图进行统计（Stats-Histogram Stats ）,对M1和M2进行统计:File
name,Marker,%Gate,Mean,CV 。

三个图形都设置完毕，File中选择SAVE AS,保存模板ACQ文件。

12.3.2联机Acquire-Connect to cytometer ，出现Acquisition Control 窗口，出现Acquisition Control 和Browser 窗口，先将Browser 窗口最小化；
12.3.3数据获取前的设定：Acquire-Accquisition ＆Storage- 设定获取细胞数（20000）-OK；Acquire-Parameter Discription 对话框（Browser 窗口最大化）选择：
-Directory :单击Change设定存储数据文件的文件夹；
-File :设定数据文件的名字：文件前缀（Prefix ）-自定义；文件后缀（Surfix ）-管号（设为1）,
单击OK；
12.3.4打开获取条件窗口，调出实验获取条件（Instrument Setting ）；
12.3.4.1Cytometer-Instrument Setting-open 打开实验获取条件（Facstation-BD
file-Instrument Setting Files- Calibur file 或者Calibur file.LNW）Open-Set-Down.
12.3.4.2Cytometer-Detectors/Voltage ，Threshold,Compensation ，Status ；
-Detectors/ Voltage ：所有的参数都设定为Lin （线性），左下去掉Four Color 前的勾，右下角DDM模式设为FL2;
-Threshold :设为FL2，调为0-20 ；
-Compensation ：全部调为0，关闭窗口。

实验条件的调整：Acquisition Control ? Setup- 上羊-Acquire- 进行实验获取条件的调整
-将机器设定为：LOW+RUN（低速上样）
-调整FSG SSC电压，使将要获取的细胞群完全显示在合适的位置；
-调节P4（FL2-H）电压，使图3中FL2-A 的面积峰调节在200道左右的位置；
-调节P7（FL2-W）和电压，使图2中细胞团调节在200-400的位置。

12.3.4.3：Cytometer-Instrument Setting-Save 保存实验获取条件( DNA-InstrSetting )-Done( 此
步骤为可选项) 。

12.3.5顺序上样，获取数据文件：Acquisition Control- □ Setup- 上样-Acquire- 仪器获取足够细胞后，自动保存数据文件( data file )。

12.3.6断开联机Acquire-Disconnect to cytometer ；
12.3.7File 下退出CellQuest/CellQuest Pro 软件。

12.4Analysis 数据分析(用ModFIT 软件)
1241在苹果菜单下打开ModFIT软件，OK-OK进入软件主屏；
12.4.2在File 下打开数据保存文件夹，文件夹类型设为ALL File ，选出待分析的文件；
1243 选择参数Choose parameter of analysis ，选P6 (FL2-A),双击;
12.4.4在设门中选择Defile gate
-Gate1 : X轴选P7(FL2-W),Y轴选P6(FL2-A),OK,然后在图中圈出你所要分析的细胞；
-Gate2 : X轴选P1(FSC),Y轴选P2(SSC),OK,然后在图中圈出你所要分析的细胞；
-OK 后出现一个峰图。

12.4.5对这个图进行分析
12.4.5.1自动分析(点击工具栏中的Auto 键)。

12.4.5.2手动分析：
1)单击工具栏中的Mod键：选择分析所要的参数(是否有凋亡Apoptosis，是否有标准参照Standard ，是否有聚集体)，选择有几个Cycle (二倍体、四倍体、异倍体)，并对每一个循环是否有S期和G2/M 期进行定义-OK；
2)确认每个峰的位置，并将Range放置于不同的峰上；
3)单击工具栏中的Fit 键，软件开始以最小乘法拟合曲线，并进行统计；
4)此外，还可以点击工具栏中的Diags 键来得到关于分析结果的一系列评估指标。

12.4.6Save As 保存分析结果，Print 打印分析结果
12.5结果报告:
报告中至少应包含以下信息：①DNA倍体，包括所有群体的DI②主要G1峰的CV③S期比例④必要的
简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等
相关记录
《流式细胞仪BD FACSCalibur 使用登记表》。