狐狸和貉子动物源性成分双重PCR鉴别

狐狸和貉子动物源性成分双重PCR 鉴别
杜利强1，章晶晶2，张 涛2，齐艳玲1，李顺才1，李 岩2，周 巍2,*，张 岩2,*
（1.河北科技师范学院生命科技学院，河北 昌黎 066604；
2.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050071）
摘 要：根据狐狸和貉子线粒体基因中保守序列设计特异性引物，建立一种基于双重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR ）的肉及肉制品狐狸和貉子源性成分鉴定方法，同时通过双重PCR 体系可一次反应同时扩增出狐狸和貉子条带，凝胶电泳条带整齐，背景清晰。

结果表明：建立的狐狸和貉子动物源性PCR 测定方法具有良好的特异性和灵敏度，其中狐狸引物单体系最低检测量为10 pg ，貉子引物单体系最低检测量为1 pg ，双重PCR 体系由于引物的竞争作用使狐狸和貉子两种引物的检测灵敏度均降低至单体系的1/10。

关键词：狐狸；貉子；双重PCR ；肉类掺假
Duplex PCR Distinction of Food Ingredients Derived from Alopex lagopus and Nyctereutes procyonoides
DU Liqiang 1, ZHANG Jingjing 2, ZHANG Tao 2, QI Yanling 1, LI Shuncai 1, LI Yan 2, ZHOU Wei 2,*, ZHANG Yan 2,*
(1. Life Science and Technology Institute, Hebei Normal University of Science and Technology, Changli 066604, China; 2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050071, China)Abstract: Two sets of specific primers were designed based on the conserved mitochondrial gene sequences of Alopex lagopus and Nyctereutes procyonoides and used to establish a PCR method to detect ingredients derived from A. lagopus and N. procyonoides in commercial meat products. Regular and clear A. lagopus- and N. procyonoides-specific bands were amplified simultaneously by duplex PCR. The sensitivities of the A. lagopus and N. procyonoides primers were respectively 10 pg and 1 pg in separate polymerase chain reactions, respectively. By contrast, the sensitivities of the A. lagopus and N. procyonoides primers were respectively 100 pg and 10 pg in duplex PCR due to the competition of two sets of primers.Key words: Alopex lagopus ; Nyctereutes procyonoides ; duplex PCR; meat adulteration DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708047
中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）08-0303-05
引文格式：
杜利强, 章晶晶, 张涛, 等. 狐狸和貉子动物源性成分双重PCR 鉴别[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 303-307. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708047.
DU Liqiang, ZHANG Jingjing, ZHANG Tao, et al. Duplex PCR distinction of food ingredients derived from Alopex lagopus and Nyctereutes procyonoides [J]. Food Science, 2017, 38(8): 303-307. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708047.
收稿日期：2016-06-23
基金项目：河北省科技厅重点研发计划项目（16275502D ）；河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（QN2014159）作者简介：杜利强（1977—），男，讲师，硕士，研究方向为动植物生态及生理。

E-mail ：dlq9445@
*通信作者：周巍（1983—），男，高级工程师，博士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。

E-mail ：zhouwei0311@
张岩（1979—），男，正高级工程师，博士，研究方向为食品安全。

E-mail ：snowwinglv@
近年来，随着人们生活水平的提高及对肉类产品消费需求的不断增长，一些不法商家为肉类掺假所带来的巨大经济利益诱惑，铤而走险用低价劣质肉冒充高价优质肉。

我国北方河北、山东等地，由于狐狸和貉子其皮毛的保暖性良好常被大量养殖，其毛皮被用作名贵衣料。

在巨额利益驱使下，不法商贩将狐狸和貉子肉冒充驴肉狗肉进行销售[1-2]，更有甚者用水浸泡后加入保水
剂、去味增香剂后放进速冻间速冻之后加工包装成价格昂贵的羊肉卷、火腿肠获取暴利。

根据国家相关规定，狐狸和貉子属于特种养殖，肉类未经检验检疫是不能进入餐饮行业的[3]。

目前国内养殖的狐狸，养殖户为了让狐狸皮早日成熟而自行给狐狸注射激素，注射过激素的狐狸肉更是不能被人食用的[2]。

这类“掺杂使假”产品投入市场不仅严重影响消费者身体健康也严重扰乱了肉类食
品市场秩序。

因此，建立一种快速高效的食品中狐狸和貉子肉源性成分检验方法迫在眉睫[4]。

目前肉类鉴定方法主要有以下几种。

一类是基于肉类的解剖学和组织学特征通过肌肉和脂肪外观、颜色、气味、质地味道为肉类品种品质鉴定提供初步判断[5]。

一类根据不同物种肉类间差异性化学测试检测肉类品种[6]，如化学检测高糖原鉴定马肉，但测定结果易受干扰。

一类基于蛋白质的检测方法，如十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、酶联免疫吸附实验[7-9]，但此类方法昂贵、耗时、复杂、缺乏特异性且只适用于对新鲜肉类而且使用受限。

基于DNA的高温稳定性和高守恒性，DNA分析法是目前最广泛使用的鉴定肉类品种的方法，如核酸探针杂交、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[10]、DNA指纹分析[11-12]、PCR特异扩增[13-15]等。

本实验根据狐狸和貉子动物线粒体基因的差异位点、设计特异性引物，通过优化PCR反应体系，建立一次PCR反应可同时扩增出狐狸和貉子物种的特异性片段，旨在建立狐狸和貉子源性成分分析的多重PCR，为食品和饲料中狐狸和貉子源性成分的鉴别检测提供可靠的技术手段和执法依据。

1 材料与方法
1.1材料与试剂
实验用牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉和驴肉均购于石家庄市北国超市新石店，狗肉、兔肉、鼠肉均由河北师范大学生命科学学院提供，狐狸和貉子肉来自秦皇岛市昌黎狐狸和貉子养殖基地。

2×Taq PCR Master Mix TaKaRa、SYBR Premix Ex Taq（RR420）大连宝生物工程有限公司；100 bp DNA Ladder Marker美国Thermo Scientific公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP 304-03天根生化科技有限公司；琼脂糖G-10法国Biowest公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）天津市博迪化工有限公司；乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；冰乙酸（分析纯）天津市百世化工有限公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2仪器与设备
DXY-33A型电泳仪北京市六一厂；Gel Doc XR 凝胶成像系统美国伯乐公司；1-14台式小型离心机德国Sigma公司；nano drop lite核酸蛋白分析仪美国Thermo公司；6400型恒温金属浴上海东升仪器有限公司；480实时荧光定量PCR仪德国罗氏公司。

1.3方法
1.3.1PCR引物设计
根据狐狸线粒体基因序列（G e n B a n k登录号为AF365968.1）设计并确定特异性引物对：狐狸-F、狐狸-R；根据貉子线粒体D-loop基因序列（GenBank登录号为AB292740.1）设计并确定特异性引物对：貉子-F、貉子-R；具体信息见表1。

表 1 引物序列与目的扩增产物大小
Table 1 Primer sequences used for PCR and sizes of PCR products 引物引物序列5’→3’目的扩增产物大小/bp 狐狸-F正：GGATCATACATGACTGCACG
152
狐狸-R反：CCAGATGCCAGGTATAGTTC
貉子-F正：CAAGGACATGCTCAAGTTGC
105
貉子-R反：CCGGAGCGAGAAGAGGTACA
1.3.2 样品预处理和DNA提取
使用灭菌手术剪在待检肉样的不同部位取样，为防止研磨过程产热而发生DNA降解和断裂从而保证DNA的完整性，将不同部位取下的肉样置于灭菌研钵中剪碎，加入液氮充分研磨。

按照试剂盒说明进行DNA基因组DNA提取，提取的DNA溶解于三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA，TE）缓冲液中并根据实验需要进行适度稀释，以TE缓冲液做空白对照在核酸蛋白分析仪上测定DNA的浓度和纯度。

为保证提取的DNA质量，A260 nm/A280 nm一般控制在1.8～2.0，比值过高说明残存的RNA较多，比值过低说明提取过程不彻底DNA受到蛋白杂质或者酚类物质的污染。

1.3.3 PCR反应体系及扩增条件
反应体系（25 μL）：2×T aq PCR Master Mix 12.5 μL，primer-F（10 μmol/L）1 μL，primer-R（10 μmol/L）1μL，模板DNA 1 μL，dd H2O补足至25 μL。

扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.4 引物特异性检测
使用狐狸的引物，分别以狐狸、貉子、牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、驴、兔、鼠的DNA模板进行PCR扩增；使用貉子的引物，分别以狐狸、貉子、牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、驴、兔、鼠的DNA模板进行PCR扩增，鉴定引物的特异性。

1.3.5 建立双重PCR方法鉴别掺假成分
SYBR荧光PCR测定狐狸和貉子引物融解曲线反应体系：2×SYBR Premix Ex T aq 25 μL，狐狸引物（10 μmol/L）各1 μL，貉子引物（10 μmol/L）各1 μL，狐狸模板100 ng，貉子模板100 ng，dd H2O补足体系50 μL。

扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，58 ℃退火及延伸20 s，40 个循环；溶解曲线95 ℃变性5 s，65 ℃退火1 min，信号采集97 ℃；50 ℃、30 s冷却仪器。

双重PCR 反应体系：预混液25 μL ，狐狸引物（10 μmol /L ） 各1 μL ，貉子引物（10 μmol /L ）各1 μL ，狐狸模板100 ng ，貉子模板100 ng ，dd H 2O 补足体系50 μL 。

1.3.6 狐狸、貉子引物灵敏度检验
将狐狸肉冻干粉、貉子肉冻干粉使用天根血液/细胞/ 组织基因组DNA 提取试剂盒提取总基因组DNA ，模板DNA 经核酸蛋白分析仪定量并系列稀释至100 ng /μL 。

将狐狸肉DNA 与貉子肉DNA 分别以100、10、1 ng ，100、10、1、0.1 pg 的为模板进行扩增，以此来检测狐狸和貉子引物普通PCR 方法的检测灵敏度。

2 结果与分析
2.1
引物特异性结果
利用狐狸引物，分别以狐狸、貉子、牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、驴、兔、鼠的DNA 为模板进行PCR 扩增；使用貉子引物，分别以狐狸、貉子、牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、驴、兔、鼠的DNA 为模板进行PCR 扩增，特异性结果见图1。

12345
6789101112M
500 bp 300 bp 200 bp 100 bp
A.狐狸引物
123456789101112
M 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp
B.貉子引物
1.狐狸；
2.貉子；
3.牛；
4.羊；
5.猪；
6.鸡；
7.鸭；
8.水；
9.狗；10.驴；11.兔；12.鼠；M. 100 bp Marker 。

图 1
引物的特异性结果Fig. 1
Specificities of different primers
图1A 显示只有狐狸DNA 模板能扩增出152 bp 目的条带且无非特异性杂带出现，而其他模板及空白对照结果均为阴性，说明狐狸引物的特异性强。

图1B 显示只有貉子DNA 模板能扩增出105 bp 目的条带且无非特异性杂带，同时其他模板及空白对照结果均为阴性，说明貉子引物的特异性强。

2.2
狐狸和貉子引物双重
PCR 特异性结果
在一个PCR 反应体系中同时加入狐狸和貉子的引物，加入两种肉样提取的DNA 混合模板，如图2所示，可同时扩增出狐狸的特异性目的条带和貉子的特异性目的条带。

两目的条带清晰，位置和相应的狐狸阳性对照组以及貉子阳性对照组也一致，由此成功建立了一次反应即可同时鉴别狐狸和貉子源性成分的检测方法，且此方法快速、简便，可为各检验机构提供方法指导。

1234567891011121314M
M 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp 500 bp 300 bp 200 bp 100 bp
M. 100 bp Marker ；1、2.分别为阳性对照、狐狸PCR ；3、4.分别为狐引物＋狐和貉模板；5、6.分别为狐和貉引物＋狐模板；7、8.分别为狐和貉引物＋狐和貉模板；9、10.分别为狐和貉引物＋貉模板；11、12.分别为貉引物＋狐和貉模板；13、14.分别为阳性对照、貉子PCR 。

图 2
双重PCR 结果
Fig. 2
Duplex PCR assay for detection of Alopex lagopus and
Nyctereutes procyonoides
为确定双重PCR 体系狐狸和貉子引物扩增产物的特异性，使用狐狸引物和貉子引物做SYBR Green Ⅰ实时荧
光PCR 检测，通过熔解曲线可以有效区分目的片段、非特异性扩增和引物二聚体并且分析熔解温度可检验引物的特异性，狐狸引物的熔解温度为83.96 ℃，貉子引物的熔解温度为82.51 ℃，见图3。

ˉ6570809095
8575∆R n
温度/ć
オⲭ ➗
䊹
䱤
⤀⤨
图 3
SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 测定狐狸和貉子引物熔解曲线Fig. 3
Melting curves of SYBR Green Ⅰ PCR for detecting Alopex lagopus and Nyctereutes procyonoides
2.3 狐狸和貉子引物灵敏度检验结果
1
2
3
4
5
6
7
8
M
500 bp 300 bp 200 bp 100 bp
A.狐狸引物
1
2
3
4
5
6
7
8M
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp
B.貉子引物
M. 100 bp Marker；1. 100 ng；2. 10 ng；3. 1 ng；
4. 100 pg；
5. 10 pg；
6. 1 pg；
7. 0.1 pg；
8. 0.01 pg。

图 4 不同引物灵敏度实验结果
Fig. 4 Sensitivities of different primers
如图4所示，单独狐狸引物PCR扩增反应体系当狐狸肉DNA量达到10 pg时，狐狸成分未被扩增出来，而单独貉子引物PCR扩增反应体系只有当貉子肉DNA量达到1 pg时，貉子成分才未被扩增出来。

说明此方法狐狸引物对狐狸源性成分的最低检测量为10 pg，貉子引物对貉子源性成分的最低检测量为1 pg。

在一个反应体系中同时加入狐狸和貉子引物，分别以100、10、1 ng，100、10、1、0.1 pg的狐狸基因组DNA与貉子基因组DNA为模板进行PCR扩增。

如图5所示，双重PCR反应体系中，狐狸探针的模板最低检测量为100 pg，这与单独狐狸引物PCR扩增反应体系最低检测量10 pg相差近9 倍，双重PCR反应体系中貉子探针的模板最低检测量为10 pg ，这与单独貉子引物PCR扩增反应体系的模板最低检测量1 pg相差9 倍，分析原因可能同一反应体系是由于两种引物的竞争作用而造成。

1
2
3
4
5
6
7
8M
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp
M. 100 bp Marker；1. 100 ng；2. 10 ng；3. 1 ng；
4. 100 pg；
5. 10 pg；
6. 1 pg；
7. 0.1 pg；
8. 0.01 pg。

图 5 狐狸和貉子引物双重PCR灵敏度实验结果
Fig. 5 Sensitivity of dual PCR assays in detecting Alopex lagopus and
Nyctereutes procyonoides
3 讨论
使用PCR方法鉴别肉类物种，一般选用线粒体DNA 而不选用基因组DNA作为鉴定肉类物种的目的基因[16]。

线粒体DNA种属特异性强且在同一个体的不同组织及结构也没有组织特异性。

同时线粒体基因在每个细胞中都存在高拷贝数，即使待检样品经高温蒸煮各种深加工处理造成核DNA严重降解或含量极低时，使用线粒体DNA 作为目的基因仍能增加阳性结果的检出概率。

动物线粒体DNA的物理结构也基本一致，其中细胞色素C氧化还原酶Ⅰ亚基[10,17-18]、16S rRNA基因[19]、12S rRNA基因[20-21]和D-loop区[22-26]都是鉴定肉类种属时常用的序列。

本研究选用狐狸线粒体一段控制序列和貉子线粒体的D-loop区实现了狐狸和貉子的特异性鉴定，可以为食品检测机构相关部门推广应用，作为实验室常规检测手段。

本研究应用到复合PCR技术，在一个反应体系中同时加入两种或两种以上引物，加入几种不同种类肉样提取的混合模板，可同步、快速、准确在单次PCR反应中鉴定出不同的动物源性成分[27-30]。

狐狸和貉子双重PCR鉴定狐狸和貉子源性成分，目的条带清晰，位置与阳性对照条带一致，可一次反应同时鉴别狐狸和貉子两种成分。

4 结论
本研究基于狐狸和貉子线粒体基因组序列设计特异性引物，建立了狐狸和貉子源性成分分析检测的方法。

实验证实，此方法针对常见畜肉牛、羊、猪、狗、驴和禽肉鸡、鸭作为模板均无扩增，并且以狗肉（同属犬科）以及兔肉和鼠肉为模板也是无扩增，本研究设计的狐狸和貉子引物的特异性良好。

经验证，单独狐狸引物的最低检测量达到10 pg，单独貉子引物的最低检测量达到1 pg，检测灵敏度较高，且目的片段较小分别为152 bp和105 bp，这在一定程度上克服了食品高温蒸煮等加工工艺对检测方法的限制。

同时本研究建立的双重PCR可在同一反应体系中加入狐狸和貉子两对引物，可以同步、准确和快速地在单次PCR反应中扩增出两种核酸片段。

狐狸引物单体系最低检测量为10 pg，貉子引物单体系最低检测量为1 pg，双重PCR 体系由于引物的竞争作用使狐狸和貉子两种引物的检测灵敏度均降低至单体系的1/10。

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