橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究

圆园21年3月
第42卷第6期
DOI ：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.06.009
作者简介：孙美君（1996—），女（汉），硕士，研究方向：应用营养。

*通信作者：李蕾（1976—），女（汉），副教授，研究方向：营养资源的
开发与应用。

橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究
孙美君1，孔杭如2，赵珈莹1，张伊瑾1，林丽颖1，郭东北1，李蕾1*
（1.厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，福建厦门361102；
2.中粮营养健康研究院，北京102200）
摘要：采用超声辅助水提法制备橄榄叶提取物（olive leaf extracts ，OLE ），测定其多酚含量，并研究OLE 对辐射小鼠
的防护作用。

给予小鼠不同剂量OLE （150、500、1000mg/kg ）后，1Gy X 射线全身辐照小鼠，测定辐射小鼠外周血细胞数量、血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）与谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase ，GSH-Px ）活力、丙二醛（malondialdehyde ，MDA ）含量、骨髓细胞微核率和肝脏Bcl-2与Bax 凋亡蛋白的表达水平。

结果表明，OLE 中的多酚含量丰富，高达（57.55±2.98）mg/g ，可有效提高小鼠外周血细胞数量与血清SOD 、GSH-Px 活性，降低MDA 含量，抑制骨髓细胞微核的形成，调控肝脏凋亡蛋白的表达，对辐射损伤具有良好的防护作用。

关键词：橄榄叶多酚；辐射损伤；外周血细胞；氧化损伤；微核
Polyphenol Analysis of Olive Leaf and Its Anti-radiation Effect on Mice
SUN Mei-jun 1，KONG Hang-ru 2，ZHAO Jia-ying 1，ZHANG Yi-jin 1，LIN Li-ying 1，GUO Dong-bei 1，LI Lei 1*
（1.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics ，Public Health School ，Xiamen
University ，Xiamen 361102，Fujian ，China ；2.COFCO Nutrition and Health Research Institute ，
Beijing 102200，China ）
Abstract ：Olive leaf extract （OLE ）was extracted by using ultrasonic-assisted water extraction method and its
polyphenol content was determined.Its protective effect on the damage of mice induced by radiation was investi -
gated as well.Different doses of OLE （150，500，1000mg/kg ）were given to mice before they were irradiated at the dose of 1Gy.The number of peripheral blood cells ，the activities of superoxide dismutase （SOD ），glu -tathione peroxidase （GSH-Px ），and the content of malondialdehyde （MDA ）of mice were measured.The bone
marrow micronucleus cells and the expression of apoptosis related proteins of liver were detected.The results showed that olive leaves were rich in polyphenols and the content was as high as （57.55±2.98）mg/g.OLE could
effectively increase the number of peripheral blood cells and the activities of SOD and GSH-Px in serum ，re -duce the content of MDA ，inhibit the formation of micronucleus in bone marrow cells and regulate the expres -sion of apoptotic proteins.It exhibited protective effect on radiation-induced damage.
Key words ：olive leaf polyphenols ；radiation damage ；peripheral blood cells ；oxidative damage ；micronucleus
引文格式：
孙美君，孔杭如，赵珈莹，等.橄榄叶中多酚含量的测定及其抗辐射作用研究[J].食品研究与开发，2021，42（6）：44-48.SUN Meijun ，KONG Hangru ，ZHAO Jiaying ，et al.Polyphenol Analysis of Olive Leaf and Its Anti-radiation Effect on Mice[J].Food Research and Development ，2021，42（6）：44-48.
辐射可以诱导细胞产生大量活性氧自由基
（reac -tive oxygen species ，ROS ），破坏生物大分子，抑制抗氧化酶活性，增加脂质代谢产物，使机体处于氧化应激
状态，从而诱发细胞凋亡、坏死[1]，导致机体出现急、慢性损伤。

橄榄叶是橄榄的副产品之一，含有橄榄苦苷、类黄酮等多酚类生物活性物质[2-4]，具有抗氧化[5-6]、抗肿瘤[7]、降血糖、降血脂[8]、消炎镇痛[9]等生物学功效，但其辐射防护作用未见报道。

本研究采用超声辅助水提工艺[10]制备橄榄叶提取物（olive leaf extracts ，OLE ），并
基础研究
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圆园21年3月第42卷第6期
测定其多酚含量。

将不同剂量的OLE灌胃给予小鼠后，采用X射线辐照小鼠，参考我国《保健食品检验与评价技术规范》中对辐射危害有辅助保护功能的评价方法，研究OLE抗辐射作用，初步探讨其作用机制，为橄榄叶的开发、利用提供理论依据。

1材料与方法
1.1材料与试剂
橄榄叶：厦门凝赋生物科技有限公司；福林酚（批号J43737）、没食子酸标准品（批号149917）：上海金穗生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）测试盒（批号20191226）、丙二醛（malon-dialdehyde，MDA）测试盒（批号20191225）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒（批号20191225）：南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红染色液（批号C0105S）、裂解液（批号P0013B）：碧云天生物技术公司；Bax抗体（批号AF0120）、Bcl-2抗体（批号AF6139）：Affinity Bioscience公司；GAPDH抗体（批号AB0037）：Abways公司；羊抗兔二抗（批号GAR001）：杭州联科生物技术有限公司。

实验动物：BALB/c雄性小鼠（清洁级），购自厦门大学实验动物中心，合格证号[SCXK（沪）2017-0005]，体重18g~22g，饲养于厦门大学实验动物中心，温度（25±2）℃，湿度50%~60%，12h昼夜循环，自由进食饮水。

1.2仪器
X射线生物学辐照仪（RS2000型）：美国Rad Source 公司；全自动三分群血液细胞分析仪（BC-1800型）：深圳迈瑞公司；紫外分光光度计（T6型）：北京普析通仪器有限责任公司；石蜡切片机（RM2235型）、自动脱水机（TP1020型）、石蜡包埋机（EG1150型）、徕卡正置显微镜（DM4B型）：德国Leica公司；电泳仪（165-8033型）：美国Bio-Rad公司；超声仪（SK8200H型）：上海科导超声仪器有限公司；冻干机（LABCONCO-18型）：美国Labconco公司。

1.3橄榄叶多酚含量的测定
1.3.1橄榄叶提取物制备
参照文献[10]，称取10g橄榄叶，加入200mL水、0.125g硼砂、0.2g亚硫酸氢钠，混匀。

超声辅助提取1h，过滤，减压浓缩至60mL，按照1∶1的体积比，加入无水乙醇，4℃放置过夜。

取上清液过滤、浓缩、冷冻干燥后得到OLE干粉，4℃避光保存。

1.3.2橄榄叶中多酚物质含量测定
参考胡瑞云等[11]的方法，取20mg没食子酸标准
品加水溶解，定容至100mL，制备0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL的没食子酸工作液。

取1.5mL 工作液，加入1.5mL福林酚、2mL10%碳酸钠溶液，混匀，定容至25mL。

反应1h，空白样调零，755nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

取制备的OLE粉末，乙醇溶解，定容至100mL。

量取0.5mL，按没食子酸标准品测定方法操作，上机测定并记录吸光度值（OD）。

1.4动物实验
1.4.1样品配制
根据前期的研究结果，分别设置150、500、1000mg/kg 3个OLE剂量[12]。

根据每组小鼠的平均体重，称取适量OLE，加水溶解，超声充分混匀，配制不同浓度的OLE 水溶液。

1.4.2实验动物分组
适应性饲养7d后，将小鼠随机分为正常对照组，辐射对照组，低、中、高剂量OLE组，每组6只。

低、中、高剂量OLE组分别灌胃给予150、500、1000mg/kg OLE，灌胃量0.3mL。

正常对照组与辐射对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续30d。

第31天，除正常对照组外，其余4组小鼠均接受一次性X射线全身均匀辐射，辐射剂量为1Gy（剂量率为5cGy/s，持续20s）[13]。

照射后6h~12h内，眼球取血，分离血清，处死小鼠，取双侧股骨，剥离肝脏，液氮冷冻，-80℃保存备用。

1.5观察指标
1.5.1外周血细胞计数
采用全自动血液细胞分析仪检测外周血红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）、血小板（platelet，PLT）的数量。

1.5.2血清氧化损伤指标测定
按照试剂盒步骤，采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定血清SOD活力；采用酶促反应测定血清GSH-Px 活性；采用硫代巴比妥酸法测定血清MDA水平。

1.5.3骨髓细胞微核实验
取小鼠双侧股骨，骨髓涂片，干燥后甲醇固定10min，取出晾干。

苏木素-伊红染色液染色10min~15min，磷酸盐缓冲液冲洗，晾干，油镜观察、计数含微核的嗜多染红细胞。

1.5.4Bcl-2与Bax蛋白表达水平测定
1.5.4.1总蛋白浓度测定
将肝脏组织剪碎，每100mg肝组织加入1mL裂解液（含1%苯甲基磺酰氟），研磨提取蛋白。

将提取的样品转移至预冷的离心管中，4℃离心取上清，-20℃分装保存。

采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）
基础研究45
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组别WBC/（×109个/L ）
RBC/（×1012个/L ）
PLT/（×109个/L ）正常对照组 2.48±0.34 6.81±0.31422.50±12.39辐射对照组0.60±0.12a 4.13±0.10a 258.00±7.37a 低剂量组（150mg/kg ） 1.17±0.36a 4.42±0.27a
295.50±7.15a
中剂量组（500mg/kg ） 1.50±0.43ab 4.58±0.28a
330.33±10.16a
高剂量组（1000mg/kg ）
2.10±0.16b
5.43±0.29b
366.00±10.26ab
表1OLE 对小鼠外周血细胞数量的影响（x ⎺
±s ，n=6）Table 1Effects of OLE on peripheral blood parameters in mice （x ⎺±s ，n=6）
注：a 表示与正常对照组比较，P <0.05差异显著；b 表示与辐射对照组比较，P <0.05差异显著。

蛋白浓度试剂盒测定肝脏总蛋白含量。

1.5.4.2
Western Blot 实验
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉
（sodi-um dodecyl sulphate -polyacrylamide gelelectrophoresis ，SDS-PAGE ）法，按照蛋白样品与上样缓冲液体积比5∶1，加入上样缓冲液煮沸至变性。

上样电泳，湿法转
膜，5%脱脂奶粉封闭，加入Bcl-2与Bax 抗体（按体积比1∶1000稀释），4℃振荡孵育过夜。

用吐温20三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（tris buffered saline with tween 20，TBST ）洗涤，加入羊抗兔二抗
（按体积比1∶1000稀释），室温（25℃~28℃）振荡孵育2h ，TBST 洗涤后曝光显影。

采用Image J 软件分析蛋白表达水平。

1.6
统计学分析
数据采用均数±标准差表示，采用SPSS17.0进行
单因素方差分析、最小显著性法进行组间比较，以检验水准琢=0.05进行显著性检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2结果与分析
2.1
橄榄叶中多酚的含量
没食子酸标准曲线见图1。

如图1所示，多酚（以没食子酸计）标准曲线为
Y =29.817X +0.0195（R 2=0.9992），且在0.001mg/mL~
0.025mg/mL 范围内线性关系良好。

OLE 的OD 值为0.363±0.018，由标准曲线方程，最终得出橄榄叶多酚含
量为（57.55±2.98）mg/g 。

2.2OLE 对辐射小鼠外周血细胞的影响
各组小鼠外周血细胞数量见表1。

与正常对照组比，辐射对照组小鼠WBC 、RBC 和
PLT 数量均显著下降（P <0.05）。

与辐射对照组比较，
中、高剂量OLE 组小鼠WBC 数量均显著升高（P <0.05），高剂量组PLT 、RBC 数量显著增加。

2.3OLE 对辐射小鼠血清抗氧化酶的影响各组小鼠血清SOD 、GSH-Px 活性及MDA 含量见
表2。

与正常对照组相比，辐射对照组小鼠血清SOD 和0.90.80.70.60.50.40.30.20.10
0.0050.0100.030
没食子酸浓度/（mg/mL ）
0.0150.020Y =29.817X +0.0195R 2=0.9992
0.025图1没食子酸标准曲线
Fig.1Standard curve of gallic acid
组别SOD 活性/（U/mL ）MDA 含量/（nmol/mL ）
GSH-Px 活性/（U/mL ）
正常对照组135.68±22.85 5.65±0.73544.76±37.42辐射对照组73.92±10.29a 15.37±0.82a
383.81±31.89a
低剂量组（150mg/kg ）87.83±5.96a 13.74±0.51a 407.62±47.31a 中剂量组（500mg/kg ）101.27±12.77ab 13.25±0.63ab 441.90±27.73ab 高剂量组（1000mg/kg ）
110.42±16.73ab
10.67±0.40ab
485.71±21.88ab
表2OLE 对小鼠血清氧化损伤指标的影响（x ⎺
±s ，n=6）Table 2Effects of OLE on serum oxidative damage in mice （x ⎺
±s ，n=6）注：a 表示与正常对照组比较，P <0.05差异显著；b 表示与辐射对照组比较，P <0.05差异显著。

基础研究
0GSH-Px 活性显著降低，MDA 含量则显著升高
（P <0.05）。

与辐射对照组比，
中、高剂量OLE 组小鼠血清SOD 和GSH-Px 活性显著升高，MDA 含量明显下降
（P <0.05）。

2.4OLE 对辐射小鼠骨髓细胞微核的影响
各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率见图2。

46
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1.51.00.50
a
b
ab
b
1.51.00.50
a
ab
b
a
3210
a
ab
b
a
a.与正常对照组比较，P <0.05差异显著；
b.与辐射对照组比较，
P <0.05差异显著。

图2OLE 对小鼠骨髓细胞微核的影响
Fig.2Effects of OLE on the micronucleus rate of
mice
GAPDH Bcl-2Bax
36kDa 26kDa 20kDa
图3Bcl-2和Bax 蛋白Western blot 电泳图谱
Fig.3Electrophoresis profiles of Bcl-2and Bax protein
a.与正常对照组比较，P <0.05差异显著；
b.与辐射对照组比较，P <0.05差异显著。

图4OLE 对小鼠凋亡蛋白表达水平的影响
Fig.4Effects of OLE on expression of apoptotic protein of mice
基础研究
辐射对照组小鼠骨髓细胞微核率为（2.547±0.491）‰高于正常对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。

中、高剂量OLE 组小鼠的微核率分别为（1.860±0.274）‰，
（1.233±0.290）‰，均显著低于辐射对照组（P <0.05），其中高剂量OLE 组的骨髓细胞微核数较辐射对照组降
低51.59‰。

2.5
OLE 对小鼠凋亡蛋白表达水平的影响
Western blot 电泳图与各组小鼠蛋白表达水平见
图3、图4。

与辐射对照组相比，高剂量OLE 组小鼠Bcl-2表达水平显著升高，Bax 的表达水平显著降低（P <0.05）。

说明高剂量OLE 可有效调控小鼠肝组织中Bcl-2和
Bax 蛋白的表达水平。

3
结论与讨论
本研究测得橄榄叶中多酚含量为（57.55±2.98）mg/g 。

孔祥佳等[14]测得橄榄叶中多酚含量为
（89.00±1.40）mg/g ，高于本研究结果。

而朱静平[15]发现卡林等不同品种橄榄叶中的多酚含量约为30.09mg/g ~35.87mg/g ，低于本研究结果。

这可能与橄榄叶的种植区域、品种等不同有关。

辐射通过电离或激发体内水分子，产生大量的活性氧自由基，加剧脂质过氧化反应，使机体处于应激状态[16]。

本研究结果显示，辐射可致小鼠血清中的SOD 、GSH-Px 活性显著下降，MDA 含量增加。

给予不同剂量的OLE 后，小鼠SOD 、GSH-Px 活性升高，脂质过氧化反应减轻，且随着OLE 剂量的增加，这种作用更为显著。

提示橄榄叶酚类物质能够提高机体的抗氧化能力[17]，减轻辐射造成的氧化损伤。

左丽丽等[18]研究发现，狗枣猕猴桃多酚能够有效抑制辐射小鼠肝、肾等脏器产生MDA ，提高SOD 、GSH-Px 等酶的活性，减轻机体辐射氧化损伤，与本文结果一致。

造血系统是电离辐射最为敏感的系统之一
[19]
，外
周血WBC 、RBC 、PLT 的数量是反映受到辐射损害的造血干/祖细胞自我修复能力的指标[20]。

本实验发现，辐射对照组小鼠外周血细胞明显降低，造血干细胞自我修复能力减弱，造血功能障碍。

中、高剂量OLE 组小鼠外周血细胞数量则显著升高，说明OLE 能够减轻辐射造成的小鼠造血系统损伤，促进造血干细胞增殖分化，其作用机制可能与多酚能够降低造血干细胞内ROS 水平、恢复造血系统功能有关[21]。

金飞等[22]也证实
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第42卷第6期基础研究
辐射前给予小鼠葡多酚可以促进其造血系统恢复。

辐射容易造成染色体受损断裂，染色体断片在细胞分裂后期仍存留于细胞质中，凝缩形成微核。

因此微核率常用来评价DNA的受损情况，以及机体的修复能力[23]。

本实验发现，OLE能明显降低辐射小鼠的骨髓细胞微核率，且随着OLE剂量的升高，保护作用增强。

这可能与OLE中含有的多酚物质能够有效清除自由基、减轻生物大分子的损伤、阻断染色体畸变有关。

曹明富[24]研究发现茶多酚能够抑制辐射诱发细胞微核形成，具有抗辐射诱变的作用，与本研究结果相一致。

Bcl-2基因及其相关蛋白家族可调控多种刺激诱导的细胞凋亡。

Bcl-2蛋白表达升高可抑制细胞凋亡，维持细胞正常存活；Bax蛋白表达增加则可加速细胞凋亡[25]。

本实验中，辐射对照组小鼠抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低，促凋亡蛋白Bax表达水平升高，而高剂量OLE则可以有效逆转辐照小鼠凋亡蛋白的表达。

提示OLE能够调控Bcl-2与Bax蛋白的表达，抑制细胞凋亡，减轻辐射诱发的细胞损伤。

本结果与山楂多酚提取物可抑制紫外线诱发HaCaT细胞凋亡的研究结果[26]相一致。

综上所述，橄榄叶中多酚含量丰富，可有效提高辐射小鼠外周血细胞数量，减轻脂质过氧化损伤，抑制细胞凋亡，降低DNA损伤，对小鼠的辐射损伤具有良好的防护作用。

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加工编辑：王艳
收稿日期：2020-10-13
48。