五粮液大曲中产酯化酶红曲霉的分离及酯化酶的纯化

五粮液大曲中产酯化酶红曲霉的分离及酯化酶的纯化胡晓龙1，赵东1,2*，葛隐1，龚勇1（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡6430001；2.五粮液技术中中心，四川宜宾644000）摘要:从五粮液大曲中分离筛选出三株红色霉菌株，编号分别为M1、M2、M3，经形态观察、生理生化鉴定，初步确定此三种菌株为红曲霉。

从这三株菌种选出具有酯化活性的菌株M1进行研究，用超滤法对其产的固态发酵物浸液进行浓缩，浓缩后的固态发酵物浸液比浓缩前的酯化活力提高了2倍左右；然后又确定M1菌株固态培养时最适温度和pH 分别为33℃和3.5。

关键词：大曲;红曲霉;分离;酯化酶;纯化;超滤中图分类号：TS262.31；TS261.12；TS261.15文献标识码：BThe Isolation of Esterified Monascu s From Wuliangye Daqu and Purificationof Esterifying EnzymeHU Xiao-long 1，ZHAO Dong1,2，GE Yin 1，GONG Yong 1(.Collage of Bioengineering,Sichuan University of Science and ngineering,Zigong643000,China;2.Technical Center of Wuliangye Group,Yibin,Sichuan,644000,China)Abstract:Three strains of molds with red colour,named M 1,M 2and M 3,were isolated from Wuliangye Daqu,separately.By observing the characteristics of colony and individual,taking a series of physiological and biochemical experiments the strains M 1,M 2and M 3were initially identified as M onascus.The M 1strain,with esterifing capacity,was selected from three above strains as subject of being studied.The extract of M 1solid-state fermentation strain,was concentrated by ultrafiltration,the esterifing capacity was increased about two times;M oreover,the optimum cultured temperature and Ph of solid-state fermentation of M 1strain were 33℃and 3.5.Key words:daqu ；monascus ；isolation ；esterifying enzyme ；purification Ultrafiltration自古以来，人们都把曲比喻为“酒之骨”，要想酿得好酒，就必须先制好曲。

大曲是酿制传统大曲酒的糖化剂、发酵剂和增香剂，同时也是传统白酒酿造的中间原料和生产动力，含有多种微生物及产生的多种酶类，在酿造过程中起着重要的糖化、发酵和生香的作用，直接或间接影响白酒的产量、质量和风格[1-3]。

五粮液是全国知名的白酒企业，是典型的浓香型白酒，其大曲的生产属开放性生产，由于得天独厚的地理位置和适宜的气候，大曲在生产过程中富集了自然界的多种微生物，包括：酵母、细菌、霉菌、放线菌等多种微生物，并在白酒的发酵过程中起着很重要的作用。

红曲霉属于真菌门、子囊菌亚门、不整子囊菌纲、散囊菌目、红曲科(M onascaceae)、红曲属(M onascus)[4],是腐生真菌,其用途广泛。

近代发酵工业用它们生产葡萄糖、酒精发酵和红曲色素及用于调节血脂、降低血压等系列功能性红曲制品等[5]。

很多文献已证实，从优质的白酒大曲中可以分离到红曲霉，并且有的烟色红曲或紫色红曲具有较好的酯化作用，而酯类又是决定白酒风格的重要指标之一。

本文主要阐述产酯化酶红曲霉菌株的筛选过程、酯化酶的初步提纯以及对产酯化酶的M 1菌株在固态培养和液态培养条件下的初步研究。

1材料与方法1.1样品五粮液成熟大曲，由五粮液公司提供1.2培养基斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基，市场上可以买到，并按配方配制初筛培养基PDA 培养基：马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂15~20g 、蒸馏水1000mL 、pH 自然、另加脱氧胆酸钠1％（防止菌丝蔓延）。

收稿日期：2011-04-12作者简介：胡晓龙（1984-），男，硕士研究生，研究方向：微生物与发酵工程。

*通讯作者：赵东（1964-），男，山西洪洞县人，教授级高级工程师，硕士生导师，参加科研项目多项，获四川省科技进步二等奖，宜宾地区科技进步一等奖，发表论文多篇。

35第38卷第3期2011年05月酿酒LIQUORMAKINGVol.38.№.3May.，2011文章编号:1002-8110（2011）03-0035-04复筛培养基察氏培养基：硝酸钠3g 、磷酸氢二钾1g 、硫酸镁(M gSO 4·7H 2O)0.5g 、氯化钾0.5g 。

硫酸亚铁0.01g 、蔗糖30g 、琼脂20g 、蒸馏水1000mL 、加热溶解，分装后121℃灭菌20min 。

种子培养基：麦芽汁液体培养基固态发酵培养基：麸皮20g 、蒸馏水20mL 、pH 自然。

液态发酵培养基：同察氏培养基，不加琼脂。

酯化反应体系：乙醇20％、己酸1％、固态发酵物1g 、蒸馏水79mL 。

1.3试验方法1.3.1取成熟大曲表皮和内心各2g [6]，碾碎，加入盛有40mL 蒸馏水的100mL 的三角瓶中，摇10min 。

1.3.2吸取摇匀后清液1mL ，加入已盛好9mL 的试管中，摇匀，再从该试管中吸取1mL 稀释液再加入另外一支盛有9mL 的试管中，依次类推，这样可以得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀释液。

1.3.3在无菌操作条件下，吸取每种梯度的稀释液0.2mL 分别涂布于含有初筛培养基的平板上，每个梯度做两个平行，并做好相应的编号。

把做好标记的平板放在33℃的恒温培养箱中，培养72h ，然后观察，挑取红色可疑菌落进行复筛，经过多次复筛，直至菌种很纯。

然后观察菌落形态及显微镜下的细胞结构；1.3.4分别把筛选出的菌株M 1、M 2、M 3接种于种子培养基（接种量尽量相同），33℃，48h ；分别吸取三种菌株的培养液2ml 接种于固态培养基中，并在固态培养基的三角瓶上标记M 1、M 2、M 3，33℃，每种做三个平行试验，培养4d ；接种均在无菌条件下操作。

1.3.5把M 1、M 2、M 3的固态培养物分别取出来，33℃下，在恒温干燥箱中干燥48h ，此时，固态培养物接近干燥，分别取三种干燥发酵物1g 加入酯化反应体系，33℃下，酯化100h ，测酯化力，并用不加任何发酵物的反应作对照，从中筛选出具有酯化力的菌株。

然后取干燥发酵物50g ，33℃下，加蒸馏水50mL 制成浸液，最后可得40mL 浸液，留取5mL 浸液先存放于冰箱4℃保存，其余浸液经超滤，留浓缩液5mL 。

分别吸取浓缩前后的浸液1mL 加入酯化反应体系，并做标记，33℃下，酯化100h ，然后通过气相色谱分析浓缩前后处理液的酯化力，筛选出高产酯化酶的菌株。

1.3.6吸取M 1的种子液0.2mL ，接种于麦芽汁琼脂平板上，做三组试验，每组两个平行，分别把这三组置于30℃、33℃、35℃的恒温培养箱中培养，每隔适当的时间去测平板上菌落的直径并做记录，测过直径立即放回培养箱继续培养；然后分别制作pH 分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5麦芽汁琼脂平板各两块，吸取M 1的种子液0.2mL 分别接种于上述平板，33℃下，恒温培养，每隔适当的时间去测平板上菌落的直径并记录。

2结果与分析2.1菌落形态和个体形态观察从五粮液成熟大曲中分离到三株红曲霉分别命名为M 1、M 2、M 3。

2.1.1菌落形态观察下图是从五粮液成熟大曲中分离出的红曲霉菌株M 1,在麦芽汁琼脂培养基上培养36h 开始生长,为圆形白色绒毛状；继续培养菌落中央颜色变为浅橙色；培养到第6天时,菌落中央为深橙色；背面颜色也为橙色；边缘整齐,呈放射状；表面有绒毛状菌丝，干燥、不易挑取，如图1的图(a)、(b)，这些特征均与红曲霉菌落的特征相一致。

并且能闻到浓浓的烤香味和甜味。

菌株M 2和M 3的菌落形态与菌株M 1基本一致。

2.1.2个体形态观察由下图2可知，M 1菌株菌丝体中有横隔、分枝、多核，含橙红色颗粒，直径3~7μm ，有典型的足细胞和分生孢子囊，分生孢子单生或成链，呈球形或梨形，直径6~9μm ，这些形态特征与红曲霉的特征完全符合。

2.2生理生化特性试验按《真菌词典》上红曲霉的鉴定方法对菌株M onascusA1的主要生理生化特征进行鉴定，其试验结果与手册上红曲霉的生理生化特性比较结果见表1。

由下面的表1可以看出，目的菌株在产红色代谢产物、对大部分糖类的利用、对大豆粉有机氮的利用、水解明胶、生长温度、最适pH 等方面与紫色曲霉表现一致。

目的菌株和紫色红曲霉均能利用大多数糖类，对棉籽糖、乳糖、鼠李糖等少数(a)菌落正面(b)菌落反面图1M1菌落的形态图2菌丝体和顶囊形态36第三期2011酿酒胡晓龙，等：五粮液大曲中产酯化酶红曲霉的分离及酯化酶的纯化第三期2011糖类的利用情况具有明显的差异，但均不能利用乳糖醛酸；对像大豆粉等有机氮源均能很好的利用，但对硫酸铵等无机氮源的利用情况存在明显的差异，目的菌株和紫色红曲霉均能水解淀粉和明胶；氮源、碳源利用及明胶水解反应作为对红曲霉分类的生化指标，具有一定的价值。

红曲霉质量的鉴定：红曲霉没有统一鉴定标准,一般多感官辨别,如古田曲鉴定是:面包酱红色,纯度均匀一致,大米粒用手捻碎后不见有白色的粒状为标准。

酿酒用的红曲和着色用的红曲标准应有所区别[7-8]。

由表1可看出目的菌株与紫色红曲霉的生理生化特征很相近，其吻合率达95%以上，初步鉴定该目的菌株为紫色红曲霉。

并命名为M 1、M 2、M 3。

2.3酯化反应体系中己酸乙酯含量的测定2.3.1分析条件2.3.1.1气相色谱条件色谱柱：毛细管柱J&W 122-706260.0m ×0.25mm ×0.25μm ；程序升温：初始温度40℃，以5℃/min 升到200℃，再以10℃/min 升到230℃；载气：He （99.999%），恒流1mL/min ；进样口：初始温度230℃，分流比20∶1，进样量1μL 。