葡萄幼嫩茎叶切块组织快繁脱毒技术

葡萄栽培与酿酒 V IT I CUL TURE &ENOLOG Y 1997(2)
本文于1996-12-25收到。

葡萄幼嫩茎叶切块组织快繁脱毒技术
牛建新　蒋迪军　冯建荣　杨芳琴
(石河子大学农学院园林系,832003)
摘　要　以葡萄幼嫩茎尖、茎叶切块组织为外植体,以改良M S 为基本培养基,附加不同浓度的细胞分裂素和生长素。

诱导茎尖,茎叶切块组织,经愈伤组织形成丛生芽,获得大量愈伤组织再生植株,经指示植物鉴定,脱除了病毒。

葡萄体细胞组织培养技术是大规模繁殖葡萄去病植株的重要手段[1]。

近几年来,在葡萄外植体选择和培养技术方面已做了大量工作[2,3,4]。

迄今为止,除
利用花药培养[5]
,获得数例再生植株外,国内关于体细胞产生愈伤组织并诱导分化成苗的工作尚很少。

我们以葡萄器官为外植体,取幼嫩茎尖碎片接种于改良的M S 培养基中,经愈伤组织途径诱导出了脱毒再生植株。

为葡萄优良品种无病毒苗工厂化快速繁殖以及基因转化,奠定了良好基础。

1　材料与方法
1.1　供试材料:无核白、里扎马特、燕山等葡萄品种。

1.2　试验方法
1.2.1　外植体表面灭菌、切割、接种。

取上述品种带毒株的新梢4c m ,除去叶片,用自来水冲洗5m in ,洗去表面污物,再用蒸馏水洗1次,用75%酒精浸3-5s ,立即用无菌水洗三次,再以0.1%升汞浸6-8m in ,最后用无菌水冲洗4次,第一次1-2m in ,第二次5m in ,第三、四次各8m in ,并以无菌滤纸吸干供试材料水分,用无菌剪刀剪下0.1-1c m 的梢尖并剪碎,然后将碎片接种到预先配好的培养基中。

1.2.2　培养基　以改良M S 为基本培养基,附加不同浓度的6-BA (0-2m g L )和I AA 或I BA (0-1m g L ),组成数种培养基,代号为:愈伤组织诱导培养基为P 1-P 5、P 9、P 13,诱导不定芽培养基为P 1、P 3、P 9-P 13,丛生芽伸长培养基为P 9-0、P 9-8,其中P 9-5=P 13。

生根培养基为K 10-K 15。

各种培养基pH 值均为5.8,琼脂为5.5g L ,白砂糖浓度为2-3%。

1.2.3　培养条件　除脱分化先暗培养一周外,其余各阶段均在25-30℃,光照2000-3000L x ,光照时间10-14h d 。

1.2.4　移栽　移栽前先炼苗。

将封口膜打开,浇自
来水1-2c m 厚,放在温室或培养室内2-3d 。

将苗取出洗去培养基,去除愈伤组织,将苗栽入营养钵内。

营养钵下部2 3为腐殖质土,上部1 3为珍珠岩,并以薄膜覆盖保湿,10d 后揭膜,一个月后移栽大田或网室。

1.2.5　病毒检测　采用指示植物绿枝嫁接法鉴定,指示植物品种为LN -33、巴柯、品丽珠、圣.乔治。

嫁接时间为6月下旬,嫁接方法(1)直接在待检组培田间苗和带毒植株扦插苗上绿枝嫁接指示植物品种。

(2)将带检组培田间苗和带毒植株的绿枝嫁接在扦插繁殖的指示植物品种上。

嫁接成活后一个月开始观察症状反应,直到秋季落叶。

嫁接在指示植物品种上的第二年继续观察。

2　结果与分析
2.1　表面灭菌　外植体的表面灭菌经多次试验,最后将灭菌时间确定到适宜的范围后进行精选。

精选结果表明,①75%酒精3s +0.1%升汞7m in ;②75%酒精4s +0.1%升汞6.5m in ;③75%酒精4s +0.1%升汞7m in 等三个处理效果较好,成活率分别是为90%、90%、89%,但从恢复生长速度来看,则以75%酒精4s +0.1%升汞6.5m in 效果最好。

2.2　培养基筛选
2.2.1　愈伤组织诱导　在供试的葡萄品种中,不同外植体,在所使用的几种脱分化培养基上,均能有效地诱导愈伤组织形成。

一般接种后7210d 开始形成愈伤组织。

但不同培养基诱导出的愈伤组织类型不同。

根据其色泽和质地可分为三类:第一类为糊状、淡黄色,质地松散、无定形、生长迅速;第二类为颗粒状,呈白色或绿色,质地紧密、生长缓慢;第三类为粉状、呈白色或杂色、结构疏松,亦无定形。

这一结果与葡萄花药培养大体相似[5]。

糊状愈伤组织与粉状愈
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伤组织在培养过程中会交替转化。

个别糊状组织经3 -4个月培养,表面会出现白色粉霜,变为粉状愈伤组织,有时又会自动消失恢复为糊状。

通过筛选P9和P13为最佳培养基,在这两种培养基上诱导出的愈伤组织为绿色紧密愈伤组织,而且可以在这两种培养基上直接诱导出大量不定芽。

P5适合燕山葡萄的愈伤组织培养,但对其它品种不适合,说明不同品种对激素浓度要求不同。

P2、P4两种培养基分别加入0.1m g L和0.2m g L GA3,结果诱导出的愈伤组织均为白色疏松愈伤组织,所以愈伤组织培养最好不加GA3。

2.2.2　不定芽及不定根的分化　上述形成的愈伤组织除在P9和P13培养基中形成的以外,其它的均应及时转移到分化培养基上,否则将形成大量疏松愈伤组织,而不利于器官的分化。

愈伤组织转移到分化培养基上培养,可从愈伤组织分化出不定根或不定芽。

这主要决定生长素和细胞分裂素间的相互比例,生长素的比率高时,产生根;细胞分裂素的比率高时诱导芽。

不过不定根的形成远比不定芽的形成容易的多。

只要生长素浓度稍高一点,即可分化出大量不定根,而且生根速度较快。

所以,为使愈伤组织分化出不定芽,我们采用只加细胞分裂素,或高浓度的细胞分裂素和低浓度的生长素,结果取得了很好的效果。

通过多次反复试验,选出了适合愈伤组织分化不定芽的培养基P13和P9。

从接种至分化出不定芽只需80-90d。

而且在这种培养基上,可以迅速地分化出大量丛生芽。

2.2.3　丛生芽伸长成苗培养　葡萄由丛生芽成苗是加速繁殖的又一途径,但丛生芽在M S分化培养基上,一般芽不伸长,形不成苗,因此,须调节培养基和激素以提高成苗率。

我们把分化培养基上诱导出的丛生芽分剪继代于P9和P13培养基上,结果P9培养基只分化丛芽,不能使丛芽伸长成苗,而P13可使里扎马特形成3-5个丛生芽后迅速伸长成苗,但仅能使无核白少部分丛芽伸长成苗,但分化丛生芽效果很好,一个月左右可长满整个三角瓶。

因此,我们又对无核白葡萄丛生芽伸长成苗培养基进行了筛选,结果P9-4对丛生芽伸长成苗效果很好。

在进行此试验的同时,又进行了无核白、里扎马特茎尖、茎段形成丛生芽试验,试验结果表明P13、P9-4对无核白、里扎马特初代形成丛生芽效果也很好,对试管苗单芽茎段具有良好的繁殖效果。

说明在只有细胞分裂素而无生长素的条件下,能促进不定芽分化,适当降低BA浓度则有利于丛生芽伸长,只有配以一定的生长素才能促进芽的伸长,但生长素浓度太高则会促进根的形成。

2.2.4　生根培养　切取2～3c m长的无根苗,接种到生根培养基中,试验结果表明,K10和K13既有利于根生长又有利于芽的生长,接种后7d就出现根原基,10d左右90%的生根,1个月左右形成发达根系,茎部可长出5-6个新叶片。

但是K10可使基部发根处产生少量疏松愈伤组织,而K13则无此现象。

筛选出K10和K13生根培养基后,又进行了试管苗单芽茎段扩繁试验,结果表明,K13效果很好。

单芽茎段接种后,根、芽同时生长,一次可成苗,一般转接后, 3d单芽茎段基部产生愈伤组织,7d后发根,10-15d 抽茎,一个月后可长成具有3-8条根和4-5条生新叶的小苗。

2.3　炼苗移栽　当苗长到6-7c m,平均生根4-5条,根平均长度达4-5c m时,移入温室揭去封口膜,加自来水1-2c m厚,炼苗3d即可移栽,移栽基质和条件对成活率影响很大。

根据我们试验得出,葡萄试管苗移栽时,扣膜比不扣膜成活率高9倍,扣膜浇营养液比不浇的成活率也有所提高,但在相同时间内长出的叶片比不浇营养液的多。

另外,培养基质为纯营养土的,由于透气性差,成活率很低,仅为11%。

纯珍珠岩和1 2珍珠岩+1 2锯末的成活率可高达90%以上。

但是,成活的试管苗在基质为营养土中的生长速度远远大于在其他基质中的生长速度。

因此,我们又采用营养钵下部2 3为营养土,上部1 3为珍珠岩的移栽基质,经大量实践应用,效果很好。

揭膜时间以10d为宜。

2.4　病毒鉴定　两种嫁接方法的鉴定结果基本相同,无论是以指示植物为砧木还是以指示植物为接穗,嫁接鉴定的待检组培苗样品一直未显症状,而带毒样品则显出扇叶病和卷叶病的症状。

说明经愈伤组织途径诱导出的试管苗脱除了病毒。

3　讨论
3.1　本试验在葡萄外植体接种过程中表面灭菌是一个敏感的问题,难以列出公式,因为不同季节的葡萄新梢带菌情况不同,因此表面灭菌要求也有所差异,夏季新梢很易灭菌,而夏秋季的材料灭菌较为困难,休眠枝最难,所以取材应以春季早夏为主,冬季可利用休眠枝在温室扦插促发新梢后取样。

3.2　据Barlass等[6]报道,使用茎尖碎片培养脱除葡萄卷叶,茎痘和茎沟病毒的成功率为100%,而这些病毒采用热处理脱除则很困难,我们这次成功地获得了葡萄茎尖碎片愈伤组织再生植株。

经指示植物鉴定脱除了病毒。

说明茎叶切块愈伤组织培养可以脱除病毒。

但关于其遗传变异情况如何尚需进一步研究。

参考文献
1　H arris R,E,J,H Stevenson,Invitro p ropagati on of V i2 tis,V itis,1982,21:22-32
2　母锡金,桂耀林等.葡萄胚乳愈伤组织诱导.植物学报.
1977,19:93-94
3　贾春兰,王纪方等.葡萄试管苗繁殖技术研究.中国果树.1992,(1):25-27
4　蒋迪军,牛建新.葡萄茎尖快速繁殖研究.葡萄栽培与酿酒。

1992,(2):3-10
5　邹昌杰,李佩芬.葡萄(V itis V in if era)花粉植株的诱导.
植物学报.1981,23:79-81。

6　Barlass,M.E linm inati on of stemp iting and Co rkbark diseases from grapevine by fragm ented shoo t apex cu2 lure A nn A pp l.B i o l.1987,110:653-656
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