通过TLR4

通过TLR4/NF-κB通路探讨白藜芦醇对急性
脑出血大鼠脑损伤的作用机制
杨龙,董秀娟
摘要目的:观察白藜芦醇(RES)对急性脑出血大鼠脑组织损伤的保护作用及其机制㊂方法:将240只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组㊁模型组㊁RES低剂量组(30mg/kg)㊁RES中剂量组(60mg/kg)㊁RES高剂量组(90mg/kg)和尼莫地平组(NMP组,10mg/kg),每组40只㊂采用自体血注射法制备急性脑出血大鼠模型,造模完成后,各组分别腹腔注射给药(假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液),每日1次,共7d㊂采用Longa评分标准进行神经功能缺损评分,失重法检测脑组织含水量,测定脑血肿体积;采用苏木精-伊红(HE)染色法㊁末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)分别观察脑组织病理学改变和神经细胞凋亡;酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑组织白细胞介素-1β(IL-1β)㊁白细胞介素-6(IL-6)㊁肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;分光光度法检测脑组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)㊁过氧化氢酶(CAT)活性;免疫组织化学(IHC)法检测脑组织离子钙结合适配分子1(Iba1)表达;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测脑组织Toll样受体4(TLR4)㊁核因子-κB p65(NF-κB p65)表达㊂结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁血肿体积升高(P<0.01);血肿周围脑组织可见大量红细胞㊁脑组织水肿㊁神经细胞减少㊁细胞核固缩㊁炎性细胞浸润等病理改变;凋亡细胞数量增多,凋亡指数(AI)升高(P<0.01);脑组织IL-1β㊁IL-6㊁TNF-α㊁MDA 含量升高,SOD㊁CAT活性降低(P<0.01);小胶质细胞形态呈肥大阿米巴虫样,Iba1表达量㊁脑组织TLR4㊁NF-κB p65表达量升高(P<0.01)㊂与模型组比较,RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁脑血肿体积降低(P<0.05或P< 0.01);脑组织病理学改变和神经细胞凋亡状况均改善,AI降低(P<0.01);脑组织IL-1β㊁IL-6㊁TNF-α㊁MDA含量降低,SOD㊁CAT活性升高(P<0.05或P<0.01);小胶质细胞形态呈瘦长分枝状,Iba1表达量㊁脑组织TLR4㊁NF-κB p65表达量降低(P<0.01)㊂结论: RES可抑制脑出血大鼠脑组织炎症反应㊁氧化应激和神经细胞凋亡,减轻脑组织损伤,其机制可能与抑制小胶质细胞活化㊁抑制TLR4/NF-κB通路有关㊂
关键词急性脑出血;白藜芦醇;炎症;氧化应激;Toll样受体4/核因子-κB通路;大鼠;实验研究
d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.12.011
Mechanism of Resveratrol on Brain Injury in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage through TLR4/NF-κB Pathway
YANG Long,DONG Xiujuan
Cangzhou Central Hospital,Cangzhou061000,Hebei,China,E-mail:******************
Abstract Objective:To observe the protective effect of resveratrol(RES)on brain tissue injury in rats with acute cerebral hemorrhage. Methods:Two hundred and forty healthy Wistar rats were randomly divided into sham operation group,model group,RES low-dose group(30mg/kg),RES medium-dose group(60mg/kg),RES high-dose group(90mg/kg)and Nimodipine group(NMP group,10mg/kg), with40rats in each group.The model of rats with acute cerebral hemorrhage were established by autologous blood injection.After modeling,each group was treated with intraperitoneal injection(sham operation group and model group were treated with0.9%sodium chloride solution),once a day for7days.The neurological deficit was determined according to the Longa score,the water content of brain tissue was detected by weightlessness method,and the volume of cerebral hematoma was determined.The pathological changes of brain tissue was detected by hematoxylin-eosin(HE)staining method,the nerve cell apoptosis was detected by terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling(TUNEL).The levels of interleukin-1β(IL-1β),interleukin-6(IL-6),and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in brain tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The content of malondialdehyde(MDA),the activities of superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)were detected by spectrophotometry.The expression of ionized calcium binding adaptor molecule1(Iba1)in brain tissue was detected by immunohistochemistry(IHC).The expressions of Toll-like receptor4(TLR4)and nuclear factor-κB p65(NF-κB p65)were detected by Western Blot.Results:Compared with sham operation group,neurological deficit score,brain water content,and hematoma volume were increased in the model group(P< 0.01).Pathological changes such red blood cells,edema of brain tissue,decrease of nerve cells,nucleolysis and inflammatory cell infiltration were seen in the brain tissue around hematoma.The number of apoptotic cells,and the apoptotic index(AI)were significantly increased(P<0.01).The contents of IL-1β,IL-6,TNF-α,and MDA were increased,while the activities of SOD and CAT were decreased (P<0.01).The microglia cells were enlarged like amoeba,and the expression of Iba1was increased(P<0.01).The expressions of TLR4and,NF-κB p65in brain tissue were increased(P<0.01).Compared with the model group,neurological deficit score,cerebral water content and hematoma volume were decreased in RES medium dose group,RES high dose group,and NMP group(P<0.05or P<0.01).Brain histopathological changes and nerve cell apoptosis were improved,AI was decreased(P<0.01).The contents of IL-1β, IL-6,TNF-α,and MDA were decreased,while the activities of SOD and CAT were increased(P<0.05or P<0.01).The microglia cells were elongated and branched,and the expression of Iba1was decreased(P<0.01).The expressions of TLR4and NF-κB p65in brain tissue were decreased(P<0.01).Conclusion:Resveratrol could inhibit brain tissue inflammation,oxidative stress and nerve cell apoptosis,and reduce brain tissue injury in rats with cerebral hemorrhage.The mechanism might be related to inhibition of microglia activation and inhibition of TLR4/NF-κB pathway.
Keywords acute cerebral hemorrhage;resveratrol;inflammation;oxidative stress;Toll-like receptor4/nuclear factorκB pathway; rats;experimental study
脑出血是指自发性急性脑实质出血,具有较高的
基金项目河北省医学科学研究课题项目(No.20201544)
作者单位沧州市中心医院(河北沧州061000),E-mail:czhdxj1979@
引用信息杨龙,董秀娟.通过TLR4/NF-κB通路探讨白藜芦醇对急性脑出血大鼠脑损伤的作用机制[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21 (12):2181-2187.致死率和致残率,发病后30d内死亡率超过30%,1年内死亡率超过60%,且超过50%的幸存病人留有运动障碍㊁语言障碍㊁认知障碍等残疾[1]㊂脑出血的病理机制复杂,其中脑血肿占位㊁脑水肿㊁炎症反应㊁氧化应激及神经细胞凋亡参与疾病进展[2-3]㊂特异性存在于脑组织中的小胶质细胞是先天性免疫细胞,脑出血后
小胶质细胞被迅速激活,并分泌细胞因子㊁趋化因子等,从而参与炎症反应㊁氧化应激调节,其中Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)/核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)通路发挥着重要的调控作
用[4-6]㊂白藜芦醇(resveratrol,RES)是存在于花生㊁葡萄等多种植物中的天然多酚类化合物,具有抗炎㊁抗氧化㊁抗凋亡㊁调节免疫力等多种药理学作用[7-9];RES 通过抑制TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖所致急性肺损伤㊁缺氧/复氧所致肝损伤等发挥保护作用[10-11]㊂本研究通过制备急性脑出血大鼠模型并给予RES治疗,观察RES对急性脑出血大鼠脑组织损伤的保护作用及其机制,以期为防治脑出血提供依据㊂
1材料与方法
1.1实验动物健康清洁级雄性Wistar大鼠240只, 8周龄,体质量(230ʃ20)g,购自河北省实验动物中心[生产许可证号:SCXK(冀)2018-004],动物合格号: 202006008;分笼饲养于沧州医学高等专科学校[使用许可证号:SCXK(冀)2019-006],饲养温度25ħ,相对湿度55%~65%㊁光照周期12h/12h,自由饮水进食,适应性喂养1周后开展实验㊂本研究经沧州市中心医院动物伦理委员会批准㊂
1.2实验药物与试剂RES购自成都普斯生物科技股份有限公司(纯度ȡ99%,批号:20191207);尼莫地平(nimodipine,NMP)注射液购自辰欣药业股份有限公司(批号:202003016);末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号:20200313);白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)㊁白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)㊁肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)试剂盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)㊁超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)㊁过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司(批号:SEKR-0002㊁SEKR-0005㊁SEKR-0009㊁BC0020㊁BC0170㊁BC0200);2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(bicinchoninic acid,BCA)购自北京博奥森生物技术有限公司(批号:D10616);兔源离子钙结合适配分子1(ionic calcium binding aptamer1,Iba1)㊁TLR4㊁NF-κB㊁β-肌动蛋白(β-actin)和山羊源IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司(批号:bs-1363R㊁bs-20595R㊁bs-20355R㊁bs-0061R㊁bs-0295G);SP法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(批号:ZLI-2719);二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司(批号:DA1015)㊂
1.3实验仪器DW-2000型脑立体定位仪(成都泰盟软件有限公司);微量注射器(上海高欣玻璃仪器); Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司);Allegra21R型低温离心机(美国Beckman公司);UV-1200紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);EG1150H型包埋机㊁RM2245型石蜡切片机㊁CM1950型冰冻切片机(德国Leica公司);DYCZ-40型电泳仪(北京六一仪器厂);PAC300型转膜仪(美国Bio-Rad公司);BX43型光学显微镜(日本Olympus公司);GFL-230型烤箱(天津市莱波瑞仪器设备有限公司)㊂1.4实验方法
1.4.1动物分组㊁模型制备与给药将240只实验用Wistar大鼠随机分为假手术组㊁模型组㊁RES低剂量组㊁RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组,每组40只㊂除假手术组外,其余组均参照孟令丽等[12]报道的自体血注射法复制脑出血大鼠模型:造模前禁食禁水12h,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后,由右侧股动脉穿刺取血100μL备用,取俯卧位固定于脑立体定位仪,沿正中切开头皮与骨膜㊁暴露前囟,之后在中线右侧旁3mm及前囟前0.2mm交汇处钻孔,缓慢进针6mm后,以10μL/min速度缓慢注射50μL 自体血,留针10min后缓慢退针,无菌骨蜡封闭颅骨钻孔,逐层缝合皮肤,碘伏消毒㊂造模完成后,RES低剂量组㊁RES中剂量组㊁RES高剂量组分别每日1次腹腔注射浓度6mg/mL㊁12mg/mL㊁18mg/mL的RES 溶液[13],NMP组每日1次腹腔注射浓度2mg/mL的NMP溶液[14],假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液,注射体积均为5mL/kg,疗程均为7d㊂
1.4.2神经功能缺失评分各组随机取10只大鼠,参照Longa评分标准进行神经功能缺失评分[15]:无神经功能缺失,计0分;瘫痪侧前肢弯曲㊁不能正常伸展,计1分;不能直线行走㊁向瘫痪侧转圈,计2分;不能正常站立㊁向瘫痪侧倾倒,计3分;意识降低㊁不能主动爬行,计4分㊂评分越高说明神经功能缺失越严重㊂
1.4.3失重法测定脑组织含水量腹腔注射10%水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后,颈椎脱臼处死后断头取脑,去除嗅球㊁小脑和脑干后称重记为W1,置于100ħ烘箱中24h,烘干至恒重后称重记为W2,脑组织含水量(%)=[(W1-W2)/W1]ˑ100%㊂
1.4.4脑血肿体积各组随机取10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后,颈椎脱臼处死后断头取脑,4%多聚甲醛溶液固定72h后,以自体血注射孔为中心行0.5mm厚度冰冻切片,血肿呈暗红色,
测量血肿最大层面互为垂直的血肿最大横径(mm)和最大纵径(mm),采用多田公式计算脑血肿体积[14],脑血肿体积(mm3)=(π/6)ˑ最大横径(mm)ˑ最大纵径(mm)ˑ血肿层数ˑ切片厚度(mm)㊂
1.4.5HE染色法观察脑组织病理学改变各组随机取10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后,颈椎脱臼处死后断头取脑,去除嗅球㊁小脑和脑干,4%多聚甲醛溶液固定72h后,经石蜡包埋㊁4μm 厚度连续切片㊁展片㊁二甲苯透明㊁梯度乙醇溶液脱蜡处理后行常规HE染色,封片后采用显微镜观察脑组织病理学改变㊂
1.4.6TUNEL观察神经细胞凋亡状况取制备好的脑组织石蜡切片,经二甲苯透明㊁梯度乙醇溶液脱蜡处理后,按照TUNEL试剂盒操作说明进行处理,封片后通过显微镜观察神经细胞凋亡状况㊂凋亡指数(apoptosis index,AI)的计算:每张切片选取互不重叠的5个视野,计数视野内凋亡细胞数和细胞总数,AI (%)=(凋亡细胞数/细胞总数)ˑ100%㊂
1.4.7ELISA检测脑组织IL-1β㊁IL-6㊁TNF-α含量取各组剩余的10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3mL/kg)麻醉后,颈椎脱臼处死后断头取脑,取血肿周围大脑组织,在冰上剪碎后加入4ħ预冷裂解液,冰上静置裂解30min后,4ħ离心(转速3500r/min, 10min)后取上清液,按照ELISA试剂盒操作说明进行处理,采用酶标仪检测脑组织IL-1β㊁IL-6㊁TNF-α含量㊂1.4.8分光光度法检测脑组织MDA含量和SOD㊁CAT活性取血肿周围大脑组织经裂解且离心后的上清液,按照试剂盒操作说明进行处理,采用紫外-可见分光光度计检测脑组织MDA含量和SOD㊁CA T活性㊂1.4.9免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法检测脑组织Iba1蛋白表达取制备的脑组织石蜡切片,经二甲苯透明㊁梯度乙醇溶液脱蜡处理后,采用枸橼酸缓冲液进行抗原修复30min,冷却至室温后,采用
3%的过氧化氢溶液避光孵育10min,5%的山羊血清避光孵育30min进行再封闭,滴加Iba1抗体(1ʒ1000)4ħ避光孵育过夜,滴加二抗(1ʒ200)37ħ孵育60min 后滴加DAB染色,苏木素复染1min后0.4%盐酸乙醇溶液进行分化,自来水冲洗返蓝,之后脱水㊁二甲苯透明和封片后,采用显微镜观察脑组织Iba1蛋白表达并拍照,使用Image Pro Plus软件计算图片平均积分吸光度值(IOD)㊂
1.4.10蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测脑组织TLR4㊁NF-κB p65表达取制备的脑组织裂解溶液,4ħ离心(转速12000r/min,25min)后取上清液,BCA法进行蛋白定量后沸水浴10min,之后依次采用十二烷基酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分离蛋白㊁湿法转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜㊁5%脱脂奶粉溶液室温封闭1.5h,滴加TLR4(1ʒ800)㊁NF-κB p65(1ʒ1000)㊁β-actin(1ʒ3000)一抗4ħ孵育过夜,滴加IgG二抗(1ʒ5000)室温孵育2h,滴加DAB显色,以目标蛋白条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白相对表达量㊂
1.5统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行数据分析,符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用最小显著差异法(LSD-t)检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1各组大鼠神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁血肿体积比较与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁血肿体积增加(P<0.01);与模型组比较,RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁血肿体积均降低(P<0.05或P<0.01);与NMP组比较,RES高剂量组神经功能缺失评分㊁血肿体积降低(P<0.05);两组脑含水量比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂详见表1㊂
表1各组大鼠神经功能缺失评分㊁脑含水量㊁血肿体积比较(xʃs)
组别只数神经功能缺失评分(分)脑含水量(%)血肿体积(mm3)
假手术组10072.93ʃ1.200
模型组10 3.60ʃ0.50①83.04ʃ2.41①43.95ʃ3.62①RES低剂量组10 3.30ʃ0.6081.17ʃ2.5842.06ʃ3.97 RES中剂量组10 2.50ʃ0.40③78.46ʃ2.23②34.71ʃ3.56③RES高剂量组10 1.40ʃ0.30③④76.52ʃ1.88③23.18ʃ2.74③④NMP组10 1.80ʃ0.40③77.30ʃ1.94③27.01ʃ2.49③
模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.05,③P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,④P<0.05㊂2.2各组大鼠脑组织病理学改变假手术组大鼠脑组织未见血肿,脑组织结构和神经细胞形态均未见异
常;模型组脑组织呈片状红细胞,脑组织水肿,神经细胞形态不规则,神经细胞数量减少㊁间隙增大㊁细胞固缩㊁细胞核深染,炎性细胞浸润等病理学改变;与模型组比较,RES各剂量组和NMP组大鼠脑组织病理学呈不同程度改善,RES组上述效应呈一定的剂量依赖性㊂详见图1㊂
图1各组大鼠脑组织病理学改变(HE,ˑ200)
2.3各组大鼠神经细胞凋亡状况比较假手术组大鼠脑组织可见极少量凋亡细胞;与假手术组比较,模型组脑组织凋亡细胞数量增多;与模型组比较,RES各剂量组和NMP组凋亡细胞数量不同程度减少,RES 组上述效应呈一定的剂量依赖性㊂与假手术组比较,模型组AI升高(P<0.01);与模型组比较,RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组AI降低(P<0.01);与NMP组比较,RES高剂量组AI降低(P<0.01)㊂详见图2㊁表2㊂
图2各组大鼠神经细胞凋亡状况(TUNEL,ˑ200)
表2各组大鼠神经细胞AI比较(xʃs)单位:%
组别只数AI
假手术组10 4.07ʃ0.58模型组1059.16ʃ7.04①RES低剂量组1054.31ʃ6.12 RES中剂量组1046.72ʃ5.53②RES高剂量组1026.49ʃ3.07②③NMP组1035.18ʃ4.16②模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,③P<0.01㊂2.4各组大鼠脑组织TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6含量比较与假手术组比较,模型组大鼠脑组织TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6含量升高(P<0.01);与模型组比较,RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6含量降低(P<0.05或P<0.01);与NMP组比较,RES高剂量组TNF-α㊁IL-6含量降低(P<0.05)㊂详见表3㊂
表3各组大鼠脑组织TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6含量比较(xʃs)单位:pg/mL 组别只数TNF-αIL-1βIL-6
假手术组10 1.41ʃ0.1837.17ʃ4.267.37ʃ1.14
模型组10 2.48ʃ0.36①66.92ʃ8.08①21.48ʃ3.15①RES低剂量组10 2.20ʃ0.3460.24ʃ7.5118.64ʃ2.73 RES中剂量组10 1.94ʃ0.27②52.38ʃ6.49③14.90ʃ2.26③RES高剂量组10 1.72ʃ0.23③④43.84ʃ5.71③11.64ʃ1.73③④NMP组10 1.97ʃ0.25②48.69ʃ6.30③14.39ʃ2.15③
模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.05,③P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,④P<0.05㊂
2.5各组大鼠脑组织MDA含量和SOD㊁CAT活性比较与假手术组比较,模型组大鼠脑组织MDA含量升高,SOD㊁CAT活性降低(P<0.01);与模型组比较, RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组MDA含量降低,SOD㊁CAT活性升高(P<0.05或P<0.01);与NMP组比较,RES高剂量组MDA含量降低,SOD㊁CAT活性升高(P<0.05)㊂详见表4㊂
表4各组大鼠脑组织MDA含量和SOD㊁CAT活性比较(xʃs)
组别只数MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)CAT(U/mg)
假手术组100.64ʃ0.11 1.57ʃ0.210.96ʃ0.13
模型组10 1.17ʃ0.19①0.93ʃ0.15①0.50ʃ0.08①RES低剂量组10 1.03ʃ0.150.98ʃ0.160.57ʃ0.09 RES中剂量组100.95ʃ0.16② 1.15ʃ0.18③0.72ʃ0.12③RES高剂量组100.74ʃ0.13③④ 1.34ʃ0.22③④0.85ʃ0.14③④NMP组100.92ʃ0.14③ 1.08ʃ0.17③0.70ʃ0.11③
模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.05,③P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,④P<0.05㊂
2.6各组大鼠脑组织Iba1表达比较与假手术组比较,模型组大鼠脑组织Iba1表达升高(P<0.01),部分小胶质细胞形态呈阿米巴虫样;与模型组比较,RES 中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组Iba1表达降低(P<0.01),阿米巴虫样小胶质细胞数量减少;与NMP 组比较,RES高剂量组Iba1表达降低(P<0.01),阿米巴虫样小胶质细胞数量减少㊂详见表5㊁图3㊂
表5各组大鼠脑组织Iba1表达比较(xʃs)
组别只数Iba1
假手术组100.0200ʃ0.0041模型组100.2315ʃ0.0397①RES低剂量组100.2176ʃ0.0342 RES中剂量组100.1359ʃ0.0228②RES高剂量组100.0842ʃ0.0167②③NMP组100.1275ʃ0.2040②模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,③P<0.01㊂
图3各组大鼠脑组织Iba1表达(IHC,ˑ200)
2.7各组大鼠脑组织TLR4㊁NF-κB p65蛋白表达比较与假手术组比较,模型组大鼠脑组织TLR4㊁NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,RES中剂量组㊁RES高剂量组和NMP组TLR4㊁NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.01);与NMP组比较,RES高剂量组TLR4㊁NF-κB p65蛋白表达降低(P<0.01)㊂详见图4㊁表6㊂
图4各组大鼠脑组织TLR4㊁NF-κB p65蛋白表达条带图
(A为假手术组;B为模型组;
C为RES低剂量组;D为RES中剂量组;
E为RES高剂量组;F为NMP组)
表6各组大鼠脑组织TLR4㊁
NF-κB p65蛋白表达比较(xʃs)
组别只数TLR4/β-actin NF-κB p65/β-actin 假手术组100.08ʃ0.020.10ʃ0.03模型组100.64ʃ0.13①0.81ʃ0.16①RES低剂量组100.53ʃ0.110.76ʃ0.14 RES中剂量组100.16ʃ0.04②0.35ʃ0.07②RES高剂量组100.11ʃ0.03②③0.13ʃ0.03②③NMP组100.19ʃ0.04②0.28ʃ0.05②模型组与假手术组比较,①P<0.01;与模型组比较,②P<0.01;RES高剂量组与NMP组比较,③P<0.01㊂3讨论
急性脑出血发病率约占脑卒中的15%,是死亡率较高的脑卒中类型,且存活病人多留有严重的神经功能障碍,是临床亟待解决的难题[16]㊂脑出血病理机制复杂,其中炎症反应㊁氧化应激及继发性神经细胞凋亡在疾病进展过程中发挥着重要作用[17-18]㊂目前,西医治疗急性脑出血主要采取外科手术结合血压管理的方案,虽然可挽救部分病人生命,但死亡率和残疾率仍居高不下㊂
近年来,中医药治疗急性脑出血逐渐得到人们的关注与认可㊂中医学将脑出血归属于 中风 范畴,其病机在于 气虚血瘀㊁痰瘀阻络 [19]㊂RES是一种具有多种生物学活性的非黄酮类多酚化合物,天然存在于葡萄㊁花生㊁桑椹㊁虎杖等植物中,因1939年首次从白藜芦的根茎中提取出而得名㊂NMP是一种钙离子阻滞剂类降压药,是临床防治脑出血等急性脑血管病的常用药物㊂本研究通过自体血注射法制备急性脑出血大鼠模型,其病理生理特征与临床相似,是脑出血动物实验常用的造模方法[20]㊂本研究结果显示,经RES 或NMP治疗可改善急性脑出血大鼠神经功能,降低脑组织含水量和血肿体积,改善神经细胞病变,减轻炎性细胞浸润,抑制神经细胞凋亡,且RES的作用具有一定的剂量依赖性,RES高剂量组优于NMP组,提示RES具有抑制急性脑出血大鼠脑组织损伤,改善神经细胞凋亡的作用㊂
小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫细胞,脑出血所致血肿占位和颅内高压等将病理性刺激小胶质细胞活化,分泌细胞因子㊁炎性趋化因子,引发氧化应
激和炎性级联反应[21-22]㊂Iba1是小胶质细胞特异性蛋白,非活化状态小胶质细胞Iba1主要表达于细胞质中,呈细长分枝状;脑出血时,小胶质细胞活化,Iba1蛋白表达量升高,细胞形态呈肥大的阿米巴虫样[23]㊂本研究采用IHC法观察RES对急性脑出血大鼠脑组织Iba1表达量和形态的影响,结果显示,经RES或NMP治疗可降低Iba1表达量,减少阿米巴虫样小胶质细胞数量,RES高剂量组作用优于NMP组,提示RES具有抑制急性脑出血大鼠小胶质细胞活化的作用㊂活化的小胶质细胞将大量分泌TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6等炎性因子加重炎症反应,且IL-1β㊁TNF-α作为炎性趋化因子引发炎症级联反应[24]㊂SOD和CAT是机体重要的抗氧化酶,可清除体内过量的活性氧,减少脂质过氧化产生的毒性MDA,减轻氧化应激损伤㊂本研究结果显示,经RES或NMP治疗可降低急性脑出血大鼠脑组织TNF-α㊁IL-1β㊁IL-6㊁MDA含量,提高SOD㊁CAT活性,RES高剂量组的作用优于NMP组,提示RES可抑制急性脑出血后炎症反应,减轻氧化应激损伤㊂
存在于小胶质细胞中的TLR4是一类跨膜识别受体,在脑组织炎症反应调节过程中发挥着重要的信号传导作用[25]㊂NF-κB为TLR4下游靶基因,可被TLR4诱导表达,活化NF-κB核转位后NF-κB p65亚基与染色体特定位点结合,进而诱导炎性细胞因子释放,加重炎症反应[26]㊂本研究结果显示,经RES或NMP治疗可降低急性脑出血大鼠脑组织TLR4㊁NF-κB p65表达量,RES高剂量组作用优于NMP组,提示RES可抑制急性脑出血大鼠TLR4/NF-κB信号通路,可能是RES抑制炎症反应的重要分子机制㊂
综上所述,RES可抑制脑出血大鼠脑组织炎症反应㊁氧化应激和神经细胞凋亡,减轻脑组织损伤,其机制可能与抑制小胶质细胞活化和TLR4/NF-κB通路有关㊂本研究为RES防治脑出血提供了依据㊂
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(收稿日期:2021-11-01)
(本文编辑薛妮)。