益骨汤对骨质疏松大鼠成骨细胞相关基因表达的实验研究
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＃ 通 讯 作 者 ：姚 新 苗 ，Ｅ—ｍａｉ１：ｚｊｙｘｍｔｃｍ＠１２６．ＣＯｍ
提液 ，用 于去势 大 鼠灌 胃治疗 ）；倍 美力水溶 液 ：美 国惠 氏艾 尔 斯 特 制 药公 司艾 尔 斯 特 药 厂 制 造 ，产 品 批 号 ０５０２０９０，国 药 准 字 （２００１）Ｊ５１（２）号 。水 溶 液 浓 度 为 ９．４ ｕ ｇ／ｍｌ。氯 氨酮 ：上 海第一 生化药业 有 限公 司生产 ， 批 号沪 卫药 准字 （１９９５）第 ００１０６４号 ；ＤＫＫ１反义 寡核 苷 酸序列如下 ：５ ＬＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴ一３ 由上海 生物工 程 合 成 ；ＷＮＴＩＯｂ、 —ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＤＫＫ１酶联 免 疫 检 测 试 剂 盒 （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 美 国）；ＷＮＴ１０ｂ、Ｂ — ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１的 ＰＣＲ引物 （艾菲生 物技术 有 限公 司）；ＰＣＲ仪 （ＢＩＯ—ＲＡＤ 美 国 ）；紫外 分析 图像 处 理 仪 （上 海 天能科 技 有 限公 司 ）；电泳仪 （ＢＩＯ—ＲＡＤ 美 国 ）；半 自动生化分析仪 （上 海三科仪器有限公司）；紫外 分光光度计 （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 德 国）；海 尔冰箱 （青岛海尔股 份有 限公 司 ）；液 氮容 器 （乐 山市东 亚机 电工 贸有 限公 司 ）；双能 ｘ线骨密度仪 （型号 ：ＤＰＸ—Ｌ美 国 ＬＵＮＡＲ公司 ）。 １．３ 实验分 组 ：随机 分为 Ａ组 （假手术组）、Ｂ组 （益骨汤 治疗组）、Ｃ组 （倍美力 阳性对照组 ）、Ｄ组 （正常对照组）、 Ｅ组 （ＤＫＫ一１反义寡 核苷 酸对 照组 ）５组 ，分 １６笼 以常规 饲料喂养，自由饮水 。饲养室保持 良好通风，室温控制在 ２ｌ±１℃，湿 度 ６３％，噪音 ＜５５分贝 ，自由摄食 、饮水 ，光 照与黑暗时间为每 １２ｈ交替 。 １．４ 动物造模 ：大 鼠采 用 氯胺酮 按 ０．１ｇ／ｋｇ进行 腹腔 麻醉，然后 打开 Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ组 大 鼠腹腔，去 除双侧 卵巢，逐 层缝合 ；Ａ组 大 鼠仅 予 以单纯 剖 腹后立 即关 闭 。术后予
浙 江 中医杂志 ２０１８年 １Ｏ月第 ５３卷 第 １Ｏ期
益骨汤对骨质疏松大鼠成骨细胞相关基因中医药大 学 附属 第三 医院 浙 江 杭 州 ３１０００５
摘要 目的 ：观察 益骨汤对骨质 疏松 大鼠成骨细胞 中ＷＮＴＩＯｂ、Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１相 关基 因的 表达 水平的影响 ，探讨 ＤＫＫ１在 骨质 疏松 大鼠 中发 生的作 用及 益骨 汤促成 骨细胞增 殖的可能机 制。方法 ：将 １００只大鼠随机分 为Ａ组 （假 手术组）、Ｂ组 （益骨 汤治疗组）、ｃ组 （倍 美力阳性 对照组）、Ｄ组 （正常对照组）、Ｅ 组 （ＤＫＫ—ｌ反 义寡核 苷酸对 照组）５组 ，每组各 ２０只 ；造模成 功后 ，分 别予蒸馏水 、益骨汤 、倍 美力、蒸馏水及 ＤＫＫ１反 义寡核 苷 酸进行 干预 。培养 ３个 月后 ，用 双 能 ｘ线 骨 密度仪进 行 骨 密度测 定 ；提 取 另 一侧 股 骨 总 ＲＮＡ，行 ＲＴ—ＰＣＲ检 测 ｗＮＴ１０ｂ、Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ水 平 ；提 取 总 蛋 白，利 用 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检 测 ＷＮＴ１０ｂ、１３一ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＤＫＫ１的 蛋 白含 量 。结 果 ：益 骨 汤 治 疗 组 、ＤＫＫ一１反 义 寡 核 苷 酸 组 对 ＷＮＴ１０ｂ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ一４表 达 比正 常对照组 明显上 调 ，差异 有统计 学意 义（Ｐ＜０．０５），且 益骨 汤 治疗组 ５种基 因的表 达明显 高于其他组 ；而益骨汤 治疗组 ＤＫＫ１的表 达比正常对照组 明显下调 ，差异有统计 学意义（Ｐ＜０．０５）。结论 ：益骨 汤能够促 进 ＷＮＴ１０ｂ、１３一ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４基 因表达上调 ，可 以抑制 ＤＫＫ１ 在成 骨细胞增殖 中的过度表达 。 关键词 骨质疏松 症 成骨细胞 益 骨汤 基 因 大鼠 实验研 究
基 金 项 目 ：浙 江 省 自然 科 学 基 金 项 目基 于 经 典 Ｗｎｔ、 ＢＭＰ一２双信 号 通路 益 骨 汤促 成 骨 细胞 分化 防 治骨 质 疏松 症 的机 制研 究 ，编 号 ：ＬＺ１５Ｈ２７０００１；国 家 中医药 管理局 国家 中 医临 床 研 究 基 地 业 务 建 设 科 研 专 项 补 肾 活 血 熏 洗 法 治 疗 早 期 膝 骨 性 关 节 炎 作 用 机 制 研 究 ，编 号 ：ＪＤＺＸ２０１５２７８
骨质疏 松症 （０Ｐ）是 以骨量减 少 ，骨 强度 降低 ，导致 骨脆性 增加 、易发生 骨折为特 征 的全 身代谢 性骨病 。因 此 ，如 何有效 防治骨质 疏松症 显得尤 为重要 。中医学认 为 ，骨质疏松症 的发 生主要与 肾虚 、血瘀等 因素有关 ，其 中 肾虚 是本病 的主要 病 因 ，血 瘀是发 病 的关 键 。本 研究 通过去势法 建立绝 经后骨质疏松大 鼠模 型 ，以补 肾活血 为 主的 中药复 方益 骨汤及 ＤＫＫ一１反 义 寡核苷 酸进 行 干 预 ，观 察股 骨骨 密度 以及 检 测去 卵巢 大 鼠股 骨组 织 中 ＷＮＴＩＯｂ、 —ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１表 达水 平 的变 化 ，探讨益骨 汤治疗 骨质疏松 的可能机制 。 ｌ 材 料 与 方 法 １．１ 实验 动物 ：采用 ＳＰＦ级 １２周龄 雌性 ｓＤ大鼠 １００只 ， 体重 ２００±１０ｇ，浙江 中医药大学 实验动 物 中心 提供 ，许 可证号 ：ＳＣＸＫ（沪）２００８００１６，用于造模 。 １．２ 主要 试 剂与仪 器 ：益 骨 口服液 （方 由补 骨脂 １０ｇ， 骨碎 补 、生地 、仙灵脾 、怀 山药各 １５ｇ，丹参 ３０ｇ组成 ），由 浙江 省 中医院中药房提供 ，制成含 生药量 １．０ｇ／ｍｌ的水
提液 ，用 于去势 大 鼠灌 胃治疗 ）；倍 美力水溶 液 ：美 国惠 氏艾 尔 斯 特 制 药公 司艾 尔 斯 特 药 厂 制 造 ，产 品 批 号 ０５０２０９０，国 药 准 字 （２００１）Ｊ５１（２）号 。水 溶 液 浓 度 为 ９．４ ｕ ｇ／ｍｌ。氯 氨酮 ：上 海第一 生化药业 有 限公 司生产 ， 批 号沪 卫药 准字 （１９９５）第 ００１０６４号 ；ＤＫＫ１反义 寡核 苷 酸序列如下 ：５ ＬＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴ一３ 由上海 生物工 程 合 成 ；ＷＮＴＩＯｂ、 —ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＤＫＫ１酶联 免 疫 检 测 试 剂 盒 （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 美 国）；ＷＮＴ１０ｂ、Ｂ — ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１的 ＰＣＲ引物 （艾菲生 物技术 有 限公 司）；ＰＣＲ仪 （ＢＩＯ—ＲＡＤ 美 国 ）；紫外 分析 图像 处 理 仪 （上 海 天能科 技 有 限公 司 ）；电泳仪 （ＢＩＯ—ＲＡＤ 美 国 ）；半 自动生化分析仪 （上 海三科仪器有限公司）；紫外 分光光度计 （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 德 国）；海 尔冰箱 （青岛海尔股 份有 限公 司 ）；液 氮容 器 （乐 山市东 亚机 电工 贸有 限公 司 ）；双能 ｘ线骨密度仪 （型号 ：ＤＰＸ—Ｌ美 国 ＬＵＮＡＲ公司 ）。 １．３ 实验分 组 ：随机 分为 Ａ组 （假手术组）、Ｂ组 （益骨汤 治疗组）、Ｃ组 （倍美力 阳性对照组 ）、Ｄ组 （正常对照组）、 Ｅ组 （ＤＫＫ一１反义寡 核苷 酸对 照组 ）５组 ，分 １６笼 以常规 饲料喂养，自由饮水 。饲养室保持 良好通风，室温控制在 ２ｌ±１℃，湿 度 ６３％，噪音 ＜５５分贝 ，自由摄食 、饮水 ，光 照与黑暗时间为每 １２ｈ交替 。 １．４ 动物造模 ：大 鼠采 用 氯胺酮 按 ０．１ｇ／ｋｇ进行 腹腔 麻醉，然后 打开 Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ组 大 鼠腹腔，去 除双侧 卵巢，逐 层缝合 ；Ａ组 大 鼠仅 予 以单纯 剖 腹后立 即关 闭 。术后予
浙 江 中医杂志 ２０１８年 １Ｏ月第 ５３卷 第 １Ｏ期
益骨汤对骨质疏松大鼠成骨细胞相关基因中医药大 学 附属 第三 医院 浙 江 杭 州 ３１０００５
摘要 目的 ：观察 益骨汤对骨质 疏松 大鼠成骨细胞 中ＷＮＴＩＯｂ、Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１相 关基 因的 表达 水平的影响 ，探讨 ＤＫＫ１在 骨质 疏松 大鼠 中发 生的作 用及 益骨 汤促成 骨细胞增 殖的可能机 制。方法 ：将 １００只大鼠随机分 为Ａ组 （假 手术组）、Ｂ组 （益骨 汤治疗组）、ｃ组 （倍 美力阳性 对照组）、Ｄ组 （正常对照组）、Ｅ 组 （ＤＫＫ—ｌ反 义寡核 苷酸对 照组）５组 ，每组各 ２０只 ；造模成 功后 ，分 别予蒸馏水 、益骨汤 、倍 美力、蒸馏水及 ＤＫＫ１反 义寡核 苷 酸进行 干预 。培养 ３个 月后 ，用 双 能 ｘ线 骨 密度仪进 行 骨 密度测 定 ；提 取 另 一侧 股 骨 总 ＲＮＡ，行 ＲＴ—ＰＣＲ检 测 ｗＮＴ１０ｂ、Ｂ—ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１ ｍＲＮＡ水 平 ；提 取 总 蛋 白，利 用 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检 测 ＷＮＴ１０ｂ、１３一ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＤＫＫ１的 蛋 白含 量 。结 果 ：益 骨 汤 治 疗 组 、ＤＫＫ一１反 义 寡 核 苷 酸 组 对 ＷＮＴ１０ｂ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ一４表 达 比正 常对照组 明显上 调 ，差异 有统计 学意 义（Ｐ＜０．０５），且 益骨 汤 治疗组 ５种基 因的表 达明显 高于其他组 ；而益骨汤 治疗组 ＤＫＫ１的表 达比正常对照组 明显下调 ，差异有统计 学意义（Ｐ＜０．０５）。结论 ：益骨 汤能够促 进 ＷＮＴ１０ｂ、１３一ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４基 因表达上调 ，可 以抑制 ＤＫＫ１ 在成 骨细胞增殖 中的过度表达 。 关键词 骨质疏松 症 成骨细胞 益 骨汤 基 因 大鼠 实验研 究
基 金 项 目 ：浙 江 省 自然 科 学 基 金 项 目基 于 经 典 Ｗｎｔ、 ＢＭＰ一２双信 号 通路 益 骨 汤促 成 骨 细胞 分化 防 治骨 质 疏松 症 的机 制研 究 ，编 号 ：ＬＺ１５Ｈ２７０００１；国 家 中医药 管理局 国家 中 医临 床 研 究 基 地 业 务 建 设 科 研 专 项 补 肾 活 血 熏 洗 法 治 疗 早 期 膝 骨 性 关 节 炎 作 用 机 制 研 究 ，编 号 ：ＪＤＺＸ２０１５２７８
骨质疏 松症 （０Ｐ）是 以骨量减 少 ，骨 强度 降低 ，导致 骨脆性 增加 、易发生 骨折为特 征 的全 身代谢 性骨病 。因 此 ，如 何有效 防治骨质 疏松症 显得尤 为重要 。中医学认 为 ，骨质疏松症 的发 生主要与 肾虚 、血瘀等 因素有关 ，其 中 肾虚 是本病 的主要 病 因 ，血 瘀是发 病 的关 键 。本 研究 通过去势法 建立绝 经后骨质疏松大 鼠模 型 ，以补 肾活血 为 主的 中药复 方益 骨汤及 ＤＫＫ一１反 义 寡核苷 酸进 行 干 预 ，观 察股 骨骨 密度 以及 检 测去 卵巢 大 鼠股 骨组 织 中 ＷＮＴＩＯｂ、 —ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＭＰ一２、ＢＭＰ一４、ＤＫＫ１表 达水 平 的变 化 ，探讨益骨 汤治疗 骨质疏松 的可能机制 。 ｌ 材 料 与 方 法 １．１ 实验 动物 ：采用 ＳＰＦ级 １２周龄 雌性 ｓＤ大鼠 １００只 ， 体重 ２００±１０ｇ，浙江 中医药大学 实验动 物 中心 提供 ，许 可证号 ：ＳＣＸＫ（沪）２００８００１６，用于造模 。 １．２ 主要 试 剂与仪 器 ：益 骨 口服液 （方 由补 骨脂 １０ｇ， 骨碎 补 、生地 、仙灵脾 、怀 山药各 １５ｇ，丹参 ３０ｇ组成 ），由 浙江 省 中医院中药房提供 ，制成含 生药量 １．０ｇ／ｍｌ的水