211240636_牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查

畜牧兽医学报 2023,54(5):2030-2041
A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c a
d o i :10.11843/j
.i s s n .0366-6964.2023.05.024开放科学(资源服务)
标识码(O S I D )
:牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查
常益铭,汤 承,岳 华*
(西南民族大学畜牧兽医学院,成都610041
)摘 要:牛呼吸道合胞体病毒(b o v i n e r e s p i r a t o r y s y n c y
t i a l v i r u s ,B R S V )是引起牛呼吸道疾病综合征(b o v i n e r e -s p i r a t o r y d i s e a s e s c o m p
l e x ,B R D C )的重要病原之一,本试验旨在调查B R S V 是否在青藏高原牦牛中存在及其在患呼吸道疾病的牦牛中的分子流行情况㊂2021年3月―2022年7月,在四川省甘孜藏族自治州(甘孜州)和阿坝藏族羌族自治州(阿坝州)的10个牦牛场中收集了122份患有呼吸道疾病牦牛的深部鼻腔棉拭子,其中,91份样本来
自甘孜州,31份样本来自阿坝州,采用反转录恒温隔绝式P C R (r e v e r s e t r a n s c r i p
t i o n i n s u l a t e d i s o t h e r m a l P C R ,R T -i i P C R )方法对临床样本进行了B R S V 的检测㊂结果显示,B R S V 的平均阳性率为64.75%,其中,甘孜州的样本阳性率为73.63%,阿坝州的样本阳性率为38.71%;场阳性率为100%㊂从阳性样本中扩增到了10条完整的G 基因序列(均为Ⅲ亚群)和9条完整的F 基因序列,与G e n B a n k 中所有国外的B R S V 毒株相比,牦牛源G 和F 蛋白与本实验室最近上传的B R S V 毒株之间存在多个相同的氨基酸位点突变㊂此外,还获得了1条牦牛源的Ⅲ亚群B R S V
全基因组,与本实验室最近上传的国内肉牛源B R S V 毒株(G e n B a n k 登录号:O P 137030~O P 137034)遗传关系最近㊂本研究首次证实了B R S V 在牦牛中的存在与流行,获得了1条牦牛源的B R S V Ⅲ亚群基因组序列,
丰富了牦牛的呼吸道疾病的病原谱,为牦牛呼吸道疾病的防控提供了参考㊂关键词:牦牛;牛呼吸道合胞体病毒;分子流行病学;基因特征
中图分类号:S 852.659.5;S 852.653 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2030-12
收稿日期:2022-10-25
基金项目: 十四五 国家重点研发计划课题(2021Y F D 1600203);国家农业产业技术体系四川肉牛创新团队专项(S C C X T D -2020-13);四川省高等学校重点实验室 动物医学实验室(2021P T J S 34
)作者简介:常益铭(1994-)男,河南安阳人,硕士生,主要从事病原快速诊断技术,E -m a i l :1175031669@q q .c o m *通信作者:岳 华,主要从事动物病原生物学研究,T e l :028-********,E -m a i l :y
h u a 900@163.c o m M o l e c u l a r E p i d e m i o l o g i c a l I n v e s t i g a t i o n o f B o v i n e R e s p i r a t o r y S y n c y
t i a l V i r u s i n Y a k s C HA N G Y i m i n g ,T A N G C h e n g
,Y U E H u a *
(C o l l e g e o f A n i m a l &V e t e r i n a r y S c i e n c e s ,S o u t h w e s t M i n z u U n i v e r s i t y ,C h e n g
d u 610041,C h i n a )A b s t r a c t :B o v i n
e r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s (B R S V )i s a n i m p o r t a n t p a t h o g e n o
f b o v i n e r e s p
i r a -t o r y d i s e a s e c o m p l e x (B R D C ).T h i s e x p e r i m e n t a i m s t o i n v e s t i g
a t e w h e t h e r B R S V w e r e p r e s e n t i n T i
b e t a n p l a t e a u y a k s a n d i t s m o l e
c u l a r p r e v a l e n c e i n y a k s w i t h r e s p i r a t o r y d
i s e a s e s .O n e h u n -d r e d a n d t w e n t y
-t w o n a s a l s w a b s f r o m G a n z i (G a r z ê)T i b e t a n A u t o n o m o u s P r e f e c t u r e a n d A b a (N g a w a )T i b e t a n a n d Q i a n g A u t o n o m o u s P r e f e c t u r e w e r e c o l l e c t e d f r o m Y a k w i t h B R D C i n 10f a r m s a c r o s s S i c h u a n p r o v i n c e s f r o m M a r c h 2021t o J u l y 2022,a m o n g t h e m ,91s a m p
l e s w e r e f r o m G a n z i P r e f e c t u r e a n d 31s a m p l e s w e r e f r o m A b a P r e f e c t u r e .U s i n g r e v e r s e t r a n s c r i p
t i o n i n -s u l a t e d i s o t h e r m a l P C R (R T -i i P C R ),64.75%o f s a m p l e s t e s t e d p o s i t i v e f o r B R S V.A m o n g t h e m ,t h e p o s i t i v e r a t e i n G a n z i P r e f e c t u r e a n d A b a P r e f e c t u r e w a s 73.63%a n d 38.71%r e s p
e c -t i v e l y ,a n d t h e
f a r m p o s i t i v e r a t e w a s 100%.F u r t h e r ,10c o m p
l e t e G g e n e s w e r e i d e n t i f i e d a s s u b g r o u p Ⅲs t r a i n s ,a n d 9c o m p l e t e F g e n e s w e r e a m p l i f i e d f r o m p o s i t i v e s a m p l e s .C o m p
a r e d t o
5期常益铭等:牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查
k n o w n B R S V s t r a i n s i n G e n B a n k,G p r o t e i n s a n d F p r o t e i n s f r o m y a k s w i t h B R S V s t r a i n s p r e v i-o u s l y a m p l i f i e d b y o u r l a b o r a t o r y s h a r e d s e v e r a l i d e n t i c a l a m i n o a c i d m u t a t i o n s.M o r e o v e r,c o m-p l e t e g e n o m e s f r o m Y a k s w e r e o b t a i n e d,w h i c h w a s c l o s e s t t o t h e B R S V s t r a i n(G e n B a n k a c c e s-s i o n n u m b e r:O P137030-O P137034)u p l o a d e d r e c e n t l y b y o u r l a b o r a t o r y.I n c o n c l u s i o n,t h i s s t u d y c o n f i r m e d t h e e x i s t e n c e a n d p r e v a l e n c e o f B R S V i n y a k s f o r t h e f i r s t t i m e,o b t a i n e d a g e-n o m e s e q u e n c e o f B R S V i n t h eⅢs u b g r o u p f r o m y a k s,e n r i c h e d t h e p a t h o g e n i c s p e c t r u m o f r e-s p i r a t o r y d i s e a s e s i n y a k s,a n d p r o v i d e d a r e f e r e n c e f o r t h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f r e s p i r a t o r y d i s e a s e s i n y a k s.
K e y w o r d s:y a k s;b o v i n e r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s;m o l e c u l a r e p i d e m i o l o g y;g e n e t i c c h a r a c t e r i s-t i c s
*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Y U E H u a,E-m a i l:y h u a900@163.c o m
牛呼吸道合胞体病毒(b o v i n e r e s p i r a t o r y s y n-
c y t i a l v i r u s,B R S V)属于肺病毒科(P n e u m o v i r i-
d a e)正肺病毒属(O r t h o p n
e u m o v i r u s),是引起牛呼吸道疾病综合征(b o v i n e r e s p i r a t o r y d i s e a s e c o m-p l e x,B R D C)的重要病原[1]㊂牛是B R S V的天然宿主,但也有关于感染绵羊㊁马和猪等动物的报道[2]㊂牛在感染B R S V后主要表现为发烧㊁咳嗽㊁流鼻涕和呼吸困难等呼吸道症状,还能引起牛的繁殖障碍和免疫抑制[3-4]㊂自1967年首次发现以来,B R S V 已在世界范围内广泛流行[5-6],欧洲许多国家将B R S V与牛病毒性腹泻病毒(b o v i n e v i r a l d i a r r h o e a v i r u s,B V D V)和牛传染性鼻气管炎病毒(i n
f e c t i o u s b o v i n e r h i n o t r a c h e i t i s v i r u s,I B R V)列为危害养牛业发展的3大重要病原体[7]㊂在G e n B a n k中,自中国分离的B R S V毒株主要有6条,其中,D Q毒株(G e n B a n k登录号:MT861050)是2018年在我国黑龙江省首次发现的基因Ⅲ亚群毒株,该毒株在黑龙江省的部分肉牛场造成了急性呼吸道疾病[8]㊂剩余的5条基因组(G e n B a n k登录号:O P137030~ O P137034)是由本实验室最近上传的,5条基因组均属于Ⅲ亚群,分别来自于四川㊁内蒙古㊁宁夏㊁甘肃和山西5个省份㊂
B R S V是一种有囊膜不分节段的单股负链R N A病毒㊂基因组长度为13416~15151b p,编码11种蛋白,包括小疏水蛋白(S H)㊁融合蛋白(F)㊁附着糖蛋白(G)㊁核衣壳蛋白(N)㊁病毒R N A依赖聚合酶蛋白(L)㊁磷蛋白(P)㊁基质蛋白(M)㊁转录抗终止因子(M2-1)㊁R N A调节蛋白(M2-2)和2种非结构蛋白(N S1和N S2)㊂其中,F蛋白和G蛋白是B R S V主要的表面糖蛋白,F蛋白能够促使病毒穿入宿主细胞,使受感染细胞与邻近细胞之间发生膜融合形成合胞体,还能够刺激机体产生中和抗体[8-11]㊂G蛋白为Ⅱ型糖基化的跨膜糖蛋白,是B R S V变异最大的蛋白,负责与宿主细胞表面的受
体结合,参与病毒与宿主细胞的吸附过程,G蛋白是重要的保护性抗原,其刺激机体产生的抗体能够阻断病毒与细胞的结合,在宿主抵抗感染的过程中发挥重要作用[12]㊂曾有研究采用N和F蛋白的核苷酸序列进行B R S V亚群的分类[13],但随后证实G 基因核苷酸的进化率更高,更有利于B R S V的亚群的分类[14-15]㊂根据G基因核苷酸序列的遗传进化分析,可将其分为Ⅰ~Ⅹ10个亚群,不同亚群之间的抗原性存在差异[6,16],并且不同亚群的毒株之间具有明显的地域分布特征[17]:Ⅰ亚群毒株主要分布于英国和瑞士[18];Ⅱ亚群毒株分布于比利时㊁法国㊁丹麦㊁瑞典㊁日本[19];Ⅲ亚群毒株分布于美国㊁中国㊁意大利和土耳其等国家[5,8];Ⅳ亚群毒株分布于德国㊁比利时㊁丹麦等欧洲国家和美国[14];Ⅴ和Ⅵ亚群毒株分布于法国和比利时[14];Ⅶ和Ⅷ亚群毒株分布于意大利和克罗地亚地区[6];Ⅸ亚群毒株分布于巴西[20];第Ⅹ亚群毒株分布于日本[21]㊂
2009年,国内学者在患有B R D C牛的鼻液中分离到B R S V,证实了该病毒在中国的存在[22],随后的研究表明B R S V在我国具有较高的血清阳性率和广泛的地域分布[23-25]㊂对辽宁㊁山东㊁黑龙江㊁宁夏和内蒙古等地区患有B R D C牛群中的病原学调查显示,B R S V的阳性率为6.95%~61.2%,不同地区的检出率存在差异[26-28]㊂牦牛是我国青藏高原地区特有的经济动物,是当地人民不可或缺的生产和生活物资[29]㊂近年来,牦牛的集约化养殖发展迅速,B R D C在牦牛中的发病率也逐步上升,关于牦牛中B R D C的病原流行病学资料较少;目前已在患
1302
畜牧兽医学报54卷
有B R D C的牦牛中鉴定出I B R V㊁B V D V㊁牛冠状病毒(b o v i n e c o r o n a v i r u s,B C o V)和牛副流感3型病毒(b o v i n e p a r a i n f l u e n z a v i r u s t y p e3,B P I V3)等病毒[30-32],但是还没有关于B R S V在牦牛中感染与流行情况的报道㊂因此,本研究的目的是调查B R S V 是否在牦牛中存在及其在患有呼吸道疾病牦牛中的分子流行情况,为牦牛B R D C的防控提供参考㊂1材料与方法
1.1样本采集
2021年3月―2022年7月,在四川省甘孜藏族自治州(甘孜州)和阿坝藏族羌族自治州(阿坝州)的10个牦牛场中采集了122份患有呼吸道疾病牦牛的深部鼻腔棉拭子,91份样本采集自甘孜州的7个场,31份样本采集自阿坝州的3个场㊂病牛为6月龄以内的牦牛,主要表现为发烧㊁流鼻涕㊁咳嗽和呼吸困难等症状㊂所有的样本均在无菌采集后低温保存运输,置于15m L E P管中,-80ħ冰箱保存㊂1.2主要试剂
T r i z o l T M R e a g e n t㊁P r i m e s c r i p t T M反转录试剂盒㊁P r e m i x E x T a q(P r o b e q P C R)等购于宝生物工程(大连)股份有限公司;p C l o n e007载体㊁D H5α感受态细胞等购于擎科生物科技有限公司;G e l E x-t r a c t i o n K i t和质粒提取试剂盒均购自OM E G A B I O-T E K公司;P O C K I T T M智能型核酸分析仪等由金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司提供㊂
1.3核酸提取和c D N A的合成
在样本中加入5m L含有双抗的P B S溶液涡旋混匀,8000g离心10m i n取上清备用;将处理好的上清液经0.22μm的滤器过滤后,用T r i z o l法提取样本上清液中的总R N A,反转录为c D N A作为模板㊂
1.4B R S V病毒的检测
B R S V的检测采用本实验室建立的R T-i i P
C R 方法[33],该方法经过特异性和重复性验证,检测下限为3.45c o p e s㊃μL-1,引物和探针序列见表1,反应总体系为50μL:P r e m i x E x T a q预混酶24μL, 10μm o l㊃μL-1的探针0.15μL,10μm o l㊃μL-1的上㊁下游引物各3μL,模板1μL,使用
D
E P C H2O 补足50μL㊂
1.5完整G和F基因的扩增
根据G e n B a n k中B R S V全部的G和F基因,分别设计了1对引物用于扩增完整的G和F基因(表1)㊂所有扩增产物经过纯化后克隆到p C l o n e007载体中,再转入D H5α感受态细胞,增菌后送往上海生工生物科技有限公司成都分公司测序㊂
1.6基因组的扩增
根据G e n B a n k中B R S V的基因组序列,设计了10对引物(表1)用于B R S V全基因组的扩增㊂所有的P C R产物经纯化后连接到p C l o n e007载体中再转入D H5α感受态细胞中,测序后采用S e q m a n 进行序列拼接,并使用O R F f i n d e r寻找开放阅读框
h t t p://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/g o r f/g o r f.h t m l㊂
1.7序列分析及分型
采用D N A S t a r的M e g A l i n e程序进行序列的相似性分析㊂利用M E G A7.0.26软件进行多重序列比对,并采用邻近法构建系统发育树,重复引导值设定为1000,利用R D P4.39程序进行基因重组分析㊂2结果
2.1B R S V的检测
在122份鼻拭子样本中B R S V的平均阳性率为64.75%(79/122),其中,甘孜州牦牛样本的阳性率为73.63%(67/91),阿坝州牦牛样本的阳性率为38.71%(12/31);场阳性率为100%(10/10)㊂
2.2G基因的分子特征
在10个B R S V阳性场的临床样本中扩增出了10条完整的牦牛源B R S V G基因(G e n B a n k登录号:O P609672~O P609681),10条完整的G基因全长792b p,共编码264个氨基酸㊂本研究的10条G 基因之间的核苷酸相似性为98.4%~99.5%,氨基酸相似性为99.2%~99.6%;与G e n B a n k中Ⅲ亚群的毒株相比核苷酸相似性为87.1%~99.5%,氨基酸相似性为80.2%~99.6%㊂与10条G基因相似性最高的毒株为B O/S X1-G/21/C H(G e n B a n k 登录号:O P137024),该毒株是由本实验室最近在山西患有B R D C的肉牛鼻拭子样本中扩增而来㊂与G e n B a n k中其他的Ⅲ亚群的参考毒株相比,将本研究的10条牦牛源B R S V G基因与本实验室最近上传的18条肉牛源B R S V G基因(G e n B a n k登录号: O P137017~O P137034)有5个相同的氨基酸位点突变(H100Y㊁S105R㊁L180S㊁P198L㊁N251D);与中国的D Q毒株(G e n B a n k登录号:MT861050和MN316655)相比,牦牛源的10条G蛋白还与18条肉牛源的G蛋白共享有18个连续的核苷酸插入
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5期常益铭等:牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查表1扩增B R S V的全基因引物
T a b l e1P r i m e r s u s e d f o r P C R a m p l i f i c a t i o n o f t h e B R S V g e n o m e
名称N a m e 引物序列(5'ң3')
P r i m e r s e q u e n c e
位置
L o c a t i o n
片段长度/b p
S i z e
F1A C G C G A A A A A A T G C G T A T A R1175G T C T C A T T T A G T T T G A C C T T G C 1―11751176
F1028A A T G T C A A C C A A A T T C C C A C R2966T C T T T T C A C T T T C T T C A T C C C 1028―29661938
F2809T G T G G C T A G T G C A G G A C C R4878G G C T G T T A T G A C G A G T G A T G 2809―48782069
F4468G A T A A C A A G A G C A C A T G A A G G R6592C C A C C C A C G A T C T G T C C T 4468―65922124
F6381A A A A G C T A A T G T C A A G T A A T G T T C R8269A G C T C C T G T G A T G T C C A A T A G 6381―82691888
F8100T T C C C A G A A A A A T A C C C T T G R9956C A G A C A A T A T A A T C A A A T C A G C T T C 8100―99561856
F9713C G G C A A G C A A T G G A T G R11598C C T A A A G C T T G T G G A T C T C T C 9713―115982281
F11351A T G T T A T T T G G T G G T G G A G A C R12979A T C A G T T A T A T A T C C T T C A C C C C 11351―129791628
F12790C A A T A A A A C A C T T A A G A A T A G T C C A C R14540C T G A A T C C T T G T C A A T C T T C T T A G 12790―145401750
F14404A G G T T C T G A G G T T T A T T T A G T C C 15122R A G A A A A A A A G T A T C A A A A A C T A T C C T 14404―15122718
F T
G A A A A G Y A C C C T C A T T A C A T
R C A T C A C T T G A C C T G C T C C A T
p r o b e F AM-T G C A G G G T T A T T C A T G A A T G C A T A T G G A-B HQ11788―1920132
G-F G A T C C A T C A A C C A A T C A A G C G-R C G C C A T C C T T A T T T G C C 4476―55621086
F-F G A G C A G A G C T C C C A C A A T C A
F-R C A T A T T T G C A G G G A T T T C T T C
5263―75262273
(位于U S I I/S1毒株的n t5465―5483),导致了G 蛋白羧基末端6个氨基酸的连续插入㊂此外,10条牦牛源B R S V的G蛋白和18条肉牛源B R S V的G 蛋白与中国的D Q毒株(G e n B a n k登录号: MT861050和MN316655)的G蛋白相比共有30个共同的氨基酸突变(I24L㊁T41M㊁F90S㊁K93R㊁H100Y㊁R104Q㊁S105R㊁P125S㊁T126A㊁E128D㊁L130Q㊁P140L㊁T142A㊁P147S㊁I165L㊁L168S㊁L169P㊁Y170H㊁E177K㊁L180S㊁K187Q㊁L198P㊁L202P㊁I215T㊁L229P㊁R232K㊁I237T㊁P245S㊁P246L㊁N251D)(图1)㊂进一步分析显示,不同地域来源的牦牛源G蛋白序列没有独特的氨基酸突变㊂基于G e n B a n k中所有完整G基因的核苷酸序列采用邻近法构建系统发育树发现:本研究的10条牦牛源B R S V的G基因和本实验室最近上传的18条肉牛源的G基因共同与美国的Ⅲ亚群毒株U S I I/ S1(G e n B a n k登录号:K U159366)和B R S V\K S\467\ 2021(G e n B a n k登录号:OM328114)聚为一个大分支,证实本研究毒株为B R S V的基因Ⅲ亚群毒株(图2),而与同为基因Ⅲ亚群的中国D Q毒株(G e n-B a n k登录号:MT861050和MN316655)处于不同的两个分支㊂
2.3F全基因的分子特征
在9个B R S V阳性场的临床样本中扩增出了9条完整的B R S V牦牛源的F基因(G e n B a n k登录号:O P609673和O P609682~O P609689),9条完整F基因的全长1710b p,共编码570a a㊂本研究9条完整F基因之间的核苷酸相似性为99.3%~
99.7%,氨基酸相似性为99.7%~100%;与G e n-
B a n k中所有完整的F基因相比核苷酸相似性为
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畜牧兽医学报54卷
85%~99.5%,氨基酸相似性为88.3%~99.8%㊂与9条F基因相似性最高毒株的登录号为O P137000~O P137004,这些毒株是本实验室近期在国内多个省份患有B R D C的肉牛鼻拭子样本中扩增而来㊂与G e n B a n k数据库中所有完整的F蛋白相比,9条牦牛源的F基因和本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因(G e n B a n k登录号: O P136997~O P137016和O P137030~O P137034)发生了相同的起始密码子突变(A T G-A C G)导致编码区15个核苷酸的连续缺失(位于U S I I/S1毒株的n t5557―5572),引起F蛋白氨基末端连续5个氨基酸的缺失(位于U S I I/S1毒株F蛋白的1―5a a)(图3)㊂此外,本研究的9条牦牛源的F蛋白和25条肉牛源的F蛋白与中国的D Q毒株(G e n-B a n k登录号:MT861050和MN316656)相比共有5处相同的氨基酸位点突变(K85R㊁T111L㊁T118A㊁N385D和V462L)㊂进一步分析显示,不同地域来源的牦牛源F蛋白序列没有独特的氨基酸突变㊂基于G e n B a n k中所有完整F基因的核苷酸序列采用邻近法构建系统发育树发现:本研究的9条牦牛源F基因和本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因共同与美国的Ⅲ亚群毒株U S I I/S1(G e n-B a n k登录号:K U159366)和B R S V\K S\467\2021 (G e n B a n k登录号:OM328114)聚为一个大分支,证实牦牛源毒株为B R S V的基因Ⅲ亚群毒株(图4),与中国的D Q毒株(G e n B a n k登录号:MT861050和MN316656)则处于不同的两个分支㊂
红框.代表与D Q毒株G蛋白对比,本研究牦牛源B R S V的G蛋白与本实验室最近上传的肉牛源的G蛋白序列共同的氨基酸突变;黑框.代表对比D Q毒株G蛋白,本研究牦牛源B R S V的G蛋白与本实验室最近上传肉牛源的G蛋白共同的氨基酸插入;蓝框.代表本研究牦牛源毒株的G蛋白
T h e r e d b o x e s r e p r e s e n t t h e a m i n o a c i d m u t a t i o n s i n t h e G p r o t e i n s e q u e n c e s o f t h e B R S V s t r a i n f r o m y a k s i n t h i s s t u d y a n d t h e G p r o t e i n o f t h e b e e f c a t t l e o r i g i n B R S V s t r a i n r e c e n t l y u p l o a d e d i n o u r l a b o r a t o r y c o m p a r e d t o t h e G p r o t e i n o f t h e D Q s t r a i n;T h e b l a c k b o x e s r e p r e s e n t t h e a m i n o a c i d i n s e r t i o n s i n t h e G p r o t e i n o f t h e B R S V f r o m y a k s i n t h i s s t u d y a n d t h e G p r o t e i n o f t h e b e e f c a t t l e o r i g i n B R S V r e c e n t l y u p l o a d e d i n o u r l a b o r a t o r y c o m p a r e d t o t h e G p r o t e i n o f t h e D Q s t r a i n;T h e b l u e b o x e s r e p r e s e n t t h e G p r o t e i n s o f t h e s t r a i n s f r o m y a k i n t h i s s t u d y
图1本研究牦牛源B R S V毒株与其他中国毒株之间G蛋白氨基酸序列的多重序列比对结果
F i g.1T h e r e s u l t s o f m u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t o f
G p r o t e i n a m i n o a c i d s e q u e n c e s b e t w e e n t h e s t r a i n s o f B R S V o f y a k o r i g i n
a n d o t h e r C h i n e s e s t r a i n s i n t h i s s t u d y
4302
5期
常益铭等:
牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查
(图2 转下页)
(F i g .2 C o n t i n u e d o n t h e n e x t p a g
e )5
302
畜 牧 兽 医 学 报54卷
(续图2 C o n t i n u e d
)采用M E G A 7.0软件对序列进行对比分析,采用邻近法构建系统发育树(1000个重复)㊂һ代表本研究中B R S V 毒株的10株G 基因序列,ʏ代表本实验室最近上传的毒株的G 基因序列,Ң代表中国的D Q 毒株的G 基因序列
S e q u e n c e s w e r e c o m p a r e d a n d c l u s t e r e d b y M E G A 7.0s o f t w a r e ,T h e p h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d u s i n g t h e n e i g
h b o r -j o i n i n g m e t h o d (1000r e p l i c a t e s ).һr e p r e s e n t s 10G g e n e s e q u e n c e s o f B R S V s t r a i n s f r o m t h i s s t u d y ,ʏr e p
r e s e n t s t h e G g e n e s e q u e n c e s o f p r e v i o u s l y a m p l i f i e d s t r a i n s i n o u r l a b o r a t o r y ,Ңr e p r e s e n t s G g e n e s e q
u e n c e s o f D Q s t r a i n i n C h i n a 图2 基于完整的G 基因核苷酸序列构建的系统发育树F i g .2 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e d o n t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f c o m p
l e t e G g e n
e 橙色框.代表对比G e n B a n k 中所有完整的F 蛋白,本研究牦牛源B R S V 的F 蛋白与本实验室前期上传的肉牛源的F 蛋白在氨基端的氨基酸缺失;蓝框.代表本研究牦牛源毒株的F 蛋白T h e o r a n g e b o x e s r e p r e s e n t t h e a m i n o a c i d d e l e t i o n a t t h e a m i n o t e r m i n u s o
f t h e F p r o t e i n o f t h e y a k o r i
g i n B R S V a n d t
h e F p r o t e
i n o f t h e b e e f c a t t l e o r i g i n B R S V r e c e n t l y u p l o a d e d i n o u r l a b o r a t o r y i n t h i s s t u d y c o m p a r e d t o a l l c o m p
l e t e F p r o t e i n s i n G e n B a n k ;t h e b l u e b o x e s r e p r e s e n t t h e F p r o t e i n o f t h e s t r a i n f r o m y a k i n t h i s s t u d y
图3 本研究牦牛源B R S V 的F 蛋白与G e n B a n k 中所有完整的F 蛋白之间氨基酸序列的多重序列比对结果F i g .3 T h e m u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t r e s u l t s b e t w e e n t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e F p r o t e i n o f B R S V o f y a k o r i g
i n a n d a l l c o m p
l e t e F p r o t e i n s i n G e n B a n k 2.4 基因组的特征
成功扩增出了1条完整的牦牛源B R S V 全基
因组(G e n B a n k 登录号:O P 609672)
,命名为Y A K /S WU N -1/21/C H ,基因组全长为15143b p ㊂与G e n B a n k 中全部18条B R S V 基因组的核苷酸相似
性为73.7%~99.1%,氨基酸相似性为85.2%~
99.3%;
与全部8个Ⅲ亚群的基因组核苷酸相似性为95.6%~99.1%,氨基酸相似性为96.5%~99.3%㊂与Y A K /S WU N -1/21/C H 相似性最高的毒株为本实验室近期上传的5条B R S V 的基因组(G e n B a n k 登录号:O P 137030~O P 137034),5条基因组是由本实验室在近期从5省份患有B R D C 的肉牛鼻拭子样本中扩增而来的㊂与G e n B a n k 中所
有的B R S V 基因组相比,Y A K /S WU N -1/21/C H 有6个独特的氨基酸位点的突变:N 蛋白(E 108K ㊁
T 169N 和D 175E ),S H 蛋白(S 5F )和L 蛋白
(F 354Y 和D 683E )
㊂基于G e n B a n k 中所有B R S V 基因组的核苷酸
序列采用邻近法构建系统发育树发现:Y A K
/S WU N -1/21/C H 与本实验室最近上传的5条肉牛源的基因组(G e n B a n k 登录号:O P 137030~
O P 137034)共同与美国的Ⅲ亚群毒株U S I I /S 1
(G e n B a n k 登录号:K U 159366)和B R S V \K S \467\
2021(G e n B a n k 登录号:OM 328114)聚为一个大分支,证实牦牛源毒株为B R S V 的基因Ⅲ亚群毒株
(图5),与中国的D Q 毒株(G e n B a n k 登录号:6
302
7302
5期常益铭等:牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查
采用M E G A7.0软件对序列进行对比分析,采用邻近法构建系统发育树(1000个重复)㊂һ代表本研究中B R S V毒株的9株F基因序列,ʏ代表本实验室先前扩增的毒株,Ң代表中国的D Q毒株(M T861050a n d MN316656)
S e q u e n c e s w e r e c o m p a r e d a n d c l u s t e r e d b y M E G A7.0s o f t w a r e,T h e p h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d u s i n g t h e n e i g h b o r-j o i n i n g m e t h o d(1000r e p l i c a t e s).һr e p r e s e n t s9F g e n e s e q u e n c e s o f B R S V s t r a i n s f r o m t h i s s t u d y,ʏr e p r e s e n t s t h e p r e-v i o u s l y a m p l i f i e d s t r a i n s i n o u r l a b o r a t o r y,Ңr e p r e s e n t s D Q(M T861050a n d MN316656)s t r a i n i n C h i n a
图4基于完整的F基因的核苷酸序列构建的系统发育树
F i g.4P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e d o n t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f t h e c o m p l e t e F g e n e
畜 牧 兽 医 学 报54卷
采用M E G A 7.0软件对序列进行对比分析,采用邻近法构建系统发育树(1000个重复)㊂һ代表本研究中B R S V 毒株的全基因组序列,ʏ代表本实验室先前扩增的全基因组序列,Ң代表中国D Q 毒株的全基因组序列
S e q u e n c e s w e r e c o m p a r e d a n d c l u s t e r e d b y M E G A 7.0s o f t w a r e ,t h e p h y l o g e n e t i c t r e e w a s c o n s t r u c t e d u s i n g t h e n e i g
h b o r -j o i n i n g m e t h o d (1000r e p l i c a t e s ).һr e p r e s e n t s g e n o m e s e q u e n c e s o f B R S V s t r a i n s f r o m t h i s s t u d y ,ʏr e p
r e s e n t s t h e p r e -v i o u s l y a m p l i f i e d s t r a i n s i n o u r l a b o r a t o r y ,Ңr e p
r e s e n t s D Q s t r a i n i n C h i n a 图5 基于全基因组的核苷酸序列构建的系统发育树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e d o n t h e n u c l e o t i d e s e q
u e n c e s o f t h e g e n o m e MT 861050)
则处于不同的两个分支(图5)㊂在Y A K /S WU N -1/21/C H 中未发现有重组事件㊂
3 讨 论
B R S V 是B R D
C 的重要病原,
给养牛业造成了巨大经济损失,目前已在世界范围内广泛流
行[5-6,8]
㊂国内血清流行病学资料显示B R S V 在我国具有广泛的地域分布[23-25]
,但还未见关于牦牛感
染B R S V 的报道㊂本研究在川西北草原患B R D C 的牦牛中检测到B R S V 的阳性率为64.75%,这一结果高于内地牛群6.95%~61.2%的阳性率
[26-28]
;
阳性样本分别来自于川西北草原甘孜州和阿坝州的
10个不同牦牛场中,场阳性率高达100%,
表明B R S V 广泛流行于川西北草原的牦牛中,可能是引起川西北草原牦牛B R D C 的重要病原㊂本研究通过对G ㊁F 和基因组的核苷酸序列进行遗传进化分析发现,本研究的所有毒株均与本实验室前期扩增的Ⅲ亚群肉牛源的B R S V 毒株亲缘关系最近,表明甘孜州和阿坝州流行的B R S V 均为Ⅲ亚群毒株㊂
Ⅲ亚群毒株主要分布在美国㊁
土耳其和意大利等国家[5-6]
,该型毒株在美国曾引起了多次呼吸道疾病的暴发,给畜牧业带来了巨大的经济损失[5,34
]㊂2018
年,我国东北地区首次报道了B R S V Ⅲ亚群毒株
(D Q 株)
在肉牛中的存在[8]
,随后国内多个省份报道了Ⅲ亚群毒株的流行[
27-28]
㊂免疫接种是防控B R S V 的有效手段,
不同亚群毒株之间的抗原性存在差异[6,16]
,而国内目前还没有商品化疫苗,本试验结果为牦牛B R S V 疫苗的研制提供了参考㊂G 蛋白主要参与病毒与宿主细胞表面的受体的
结合,其诱导机体产生的抗体能够阻断病毒与宿主
细胞的结合[12
]㊂G 蛋白有3个结构域组成:胞质结
构域(1―37a a )㊁跨膜结构域(38―65a a
)和胞外结构域(66―257a a
)[35
];胞外结构域可分为中央疏水区域(C H R ;158―189a a
)和2个黏蛋白样区域(M L R :66―157a a 和190―257a a ),其中,C H R
高度保守,C H R 中的174―185a a 为免疫显性区,
分布着B R S V 重要的抗原表位[36]㊂相比G e n B a n k
中所有的Ⅲ亚群毒株(包括国内上传的D Q 毒株),本试验获得的10条牦牛源G 基因和本实验室最近上传的18条肉牛源G 基因在胞外结构域有5处相同的氨基酸突变(H 100Y ㊁S 105R ㊁L 180S ㊁P 198L ㊁
N 251D ),其中,180位的氨基酸突变(L 180S )
位于C H R 的免疫显性区内(174―185a a )
,是决定B R S V 抗原亚型的重要表位
[37-38
]㊂根据G 蛋白8
302
5期常益铭等:牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查
4个氨基酸的线性表位(180a a㊁183a a㊁184a a和205a a),可以将B R S V分为4个抗原亚型:A㊁A B㊁B 和未定型,其中,L e u180和T h r205为A亚型; L e u180和A l a205为A B亚型,P r o180(S e r183和P r o184)和A l a205为B亚型[37-38]㊂国内B R S VⅢ亚群流行毒株180位氨基酸位点的突变,使得这些毒株的抗原亚型不能确定[37-38]㊂因此,有必要进一步研究180位氨基酸突变对G蛋白抗原性的影响,为国内的B R S V疫苗研发提供参考㊂此外,与中国早期上传的D Q毒株(G e n B a n k登录号: MT861050)相比,10条牦牛源的G蛋白和18条肉牛源的G蛋白共有30个共同的氨基酸突变,这些突变广泛分布在G蛋白的3个结构域中,这些氨基酸的突变是否对G蛋白的免疫原性造成影响需要进一步研究㊂
F蛋白参与病毒与细胞膜的融合过程,能够使受感染细胞与邻近细胞发生膜融合形成合胞体,此外还能够刺激机体产生中和抗体[9-11]㊂F蛋白具有三个疏水肽,包括氨基末端信号肽区(1―26a a)㊁蛋白裂解位点(131―136a a)和疏水跨膜锚定序列(522―549a a)[4]㊂与G e n B a n k中所有完整的F 基因相比(包括国内上传的D Q毒株),本试验获得的9条牦牛源F基因与本实验室最近上传的25条肉牛源的F基因在起始密码子处发生突变(A T G-A C G),导致F蛋白氨基末端发生5个氨基酸的连续缺失,该缺失位点位于F蛋白氨基末端的信号肽区域,表明当前国内当前流行的B R S VⅢ亚群毒株的F基因有独特的进化趋势㊂目前,F蛋白氨基末端信号肽区的详细功能的尚不清楚,但关于副黏病毒科新城疫病毒的相关研究表明,当F蛋白的起始密码子突变时将对病毒的毒力产生影响[39],有必要进一步研究F蛋白起始密码子的突变对B R S V毒力的影响㊂
本研究成功扩增到一条牦牛源Ⅲ亚群的B R S V 全基因组序列,并命名为Y A K/S WU N-1/21/C H,分析发现Y A K/S WU N-1/21/C H与本实验室最近上传的肉牛源B R S V基因组(G e n B a n k登录号: O P137030~137034)相似性较高,在系统发育树上亲缘关系也最近,这表明Y A K/S WU N-1/21/C H可能是由国内肉牛源的B R S V传播而来㊂与G e n B a n k 中所有的毒株相比(包括6个中国肉牛源毒株), Y A K/S WU N-1/21/C H在N蛋白㊁S H蛋白和L蛋白表现出独特的氨基酸突变,这些蛋白在病毒的转
录㊁复制㊁对宿主免疫逃避和抑制干扰素产生等方面发挥了重要的作用[40-41]㊂这些突变可能是由于B R S V在感染牦牛过程中为适应高原环境和新宿主
而产生的[42],但还需要更多的牦牛源B R S V基因组序列来进一步验证㊂
4结论
本研究首次证实了B R S V在牦牛中的存在和流行,感染的主要为Ⅲ亚群毒株,丰富了牦牛呼吸道疾病的病原谱,并成功获得了一株牦牛源Ⅲ亚群的B R S V全基因组㊂本试验结果为牦牛呼吸道疾病的防控提供了参考,并有助于更好地了解B R S V的流行和遗传进化㊂
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