促红细胞生成素对肺腺癌A549细胞生长和凋亡作用的实验研究

促红细胞生成素对肺腺癌A549细胞生长和凋亡作用的实验
研究
陈波;赵卫红;吴剑卿
【摘要】背景与目的促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对肿瘤细胞的具体作用存在争议.本研究旨在探讨细胞因子超家族成员EPO对肺腺癌AS49细胞株生物学行为的影响.方法构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-hEPO,并转染肺腺癌A549细胞株.采用酶联免疫吸附(ELISA)法检洲转染后目的基因的蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测转染后A549细胞生长、周期及凋亡率等生物学行为的变化;ELISA 法检测转染后细胞VEGF表达水平的变化.结果成功构建真核表达质粒
pcDNA3.1(-)-hEPO;转染后各检测时间点,EPO转染组细胞生长均明显受抑
(P<0.01);流式细胞术分析表明,EPO转染组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05).且凋亡率也明显增高(P<0.01);EPO转染组VEGF表达量明显降低(P<0.01).结论EPO基因转染A549后有抑制细胞生长、促进凋亡的作用,并且还可抑制细胞表达VEGF.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2009(012)009
【总页数】5页(P956-960)
【关键词】肺肿瘤;促红细胞生成素;凋亡;血管内皮生长因子
【作者】陈波;赵卫红;吴剑卿
【作者单位】210029,南京,南京医科大学第一附属医院老年呼吸科;210029,南京,
南京医科大学第一附属医院老年呼吸科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院
老年呼吸科
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，其5年生存率不足15%。

据调
查显示，72%的血液系统肿瘤患者和66%的实体瘤患者在病程的不同阶段会有不
同程度的贫血发生，肺癌患者也不例外。

促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）能有效地改善化疗相关性贫血，提高晚期肺癌患者生活质量。

因此，EPO在肺癌
患者中有着较广泛应用。

但近年来研究表明，机体内EPO除了促进红细胞生成外，还可以通过自分泌或旁分泌形式，在细胞的有丝分裂、抑制细胞凋亡、血管生成中发挥重要作用。

据大型临床对照研究[1,2]显示，在转移性乳腺癌患者和接受放疗
的头颈癌患者中使用人重组促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin, rh-EPO），不利于肿瘤的治疗，使患者生存质量下降、生存期缩短。

然而，另外一些研究则持相反观点。

因此，EPO对肿瘤细胞的作用尚不明确，争议较大。

本研究通过将EPO基因转染入肺腺癌 A549细胞中，对转染后肿瘤细
胞生物学行为进行观察，并对可能的相关机制进行研究，以期对晚期肺癌病人合理应用 EPO提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料人肺腺癌细胞株（A549）由本实验室保存。

大肠杆菌DH5α和
pcDNA3.1(-)-hrGFP、pcDNA3.1(-)质粒购自Invitrogene公司；质粒pXL-4-hEPO购自Origene公司。

DMEM培养基和小牛血清购自Gibco公司，限制性内
切酶Not I和Kpn I、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶购自Takara 公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Qiagen公司，Epo ELISA和VEGF ELISA检测试剂盒均购自R&D公司。

1.2 方法
1.2.1 pcDNA3.1(-)-hEPO重组质粒的构建及鉴定质粒pXL-4-hEPO经Not I消化，1%琼脂糖凝胶电泳，回收约600 bp的hEPO基因片段；同时pcDNA3.1(-)经Not I酶切，并用CIAP酶去磷酸化。

将上述目的基因hEPO和载体
pcDNA3.1(-)用T4 DNA连接酶连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α，经扩增后提取质粒。

所获质粒进行酶切验证，并送上海博亚生物科技有限公司测序。

序列完全正确的克隆命名为pcDNA3.1(-)-hEPO。

1.2.2 细胞培养和基因转染 A549细胞接种于含100 mL/L小牛血清和100 μg/L 青/链霉素的DMEM培养液中，37 oC，5%CO2孵箱内培养。

细胞分3组：①空白（blank）组：未经转染的正常A549细胞；②对照（control）组：A549转染空质粒[pcDNA3.1(-)]组；③实验（experimental）组：A549转染重组质粒[pcDNA3.1(-)-hEPO]组。

具体方法参照Lipofectamine 2000说明书进行。

1.2.3 ELISA法检测细胞上清液中EPO的含量转染后24 h、48 h，分别收集细胞上清液，按ELISA试剂盒说明进行操作，酶标仪测定样品450 nm处的OD值，600 nm处OD值校正，绘制标准曲线，计算样品EPO浓度。

1.2.4 MTT法检测A549细胞的活力胰酶消化细胞，血球计数板计算细胞密度，调整为4×104个/mL，以8 000个细胞/孔接种于96孔板，并设空白对照。

37 oC、5%CO2孵箱内培养，分别于24 h、48 h、60 h和72 h取样检测，每组设6个复孔，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37 oC、5%CO2继续孵育4 h 后，弃上清，每孔加入150 mL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，测定490 nm处OD值。

根据结果绘制细胞生长曲线。

计算各组细胞生长抑制率: 抑制
率（%）=（对照组A值-转染组A值）/对照组A值×100%。

1.2.5 流式细胞术检测A549细胞细胞周期和凋亡转染48 h后，取各组细胞，胰
酶消化，加PBS悬浮成单个细胞。

PBS洗两次，加入75%乙醇，-20 oC固定过夜。

细胞离心后PBS洗1次，加入RNA酶（1 mg/mL）10 μL、PI（10 μg/mL）溶液10 μL、0.5% TritonX-100，室温避光温育30 min，加PBS 400 μL，FACSort流式细胞仪检测分析。

实验重复3次，取平均值。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中VEGF的含量转染后24 h、48 h，分别收集细
胞上清液，按ELISA试剂盒说明进行操作，酶标仪测定样品450 nm处的OD值，600 nm处OD值校正，绘制标准曲线，计算各样品VEGF浓度。

1.3 统计学分析检测数据均以Mean±SD表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。

组间差异用单因素方差分析（Oneway ANOVA），组间两两比较用LSD法，以
P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 重组质粒pcDNA
3.1(-)-hEPO的构建与鉴定质粒pcDNA3.1(-)-hEPO经限制性内切酶Not I酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳显示600 bp和4 800 bp的两个片段（图1），证明重组质粒连接正确。

测序报告证实核苷酸序列与EPO基因cDNA 序列相同（图2）。

2.2 ELISA法检测转染细胞EPO的表达水平 A549转染EPO后第1、2天细胞上
清液中的EPO水平分别为（5.00±0.47）pg/mL和（8.73±0.30）pg/mL，均明
显高于正常对照组和转染空载体组（P＜0.01），但正常对照和空载体之间差别无统计学意义（P＞0.05）。

（图3A，表1）。

2.3 EPO对细胞增殖的影响应用MTT法检测各处理组增殖情况，绘制生长曲线，图4所示转染EPO组与正常对照组、空载体组相比，各时间点生长均明显受抑制（P＜0.05）。

2.4 EPO对A549细胞凋亡和细胞周期的影响实验组S期细胞明显多于对照组和空白组（P＜0.05），G2/M期细胞则明显低于对照组和空白组（P＜0.05），表明实验组细胞周期发生了S期阻滞，并且实验组细胞凋亡率均高于其他两组（P＜0.01）。

（图5，表2）。

2.5 EPO抑制A549细胞表达 VEGF 转染24 h、48 h后ELISA法分别检测各组细胞上清液中的VEGF表达水平。

转染后24 h、48 h，实验组细胞上清液中VEGF 含量分别为（25.68±2.88）pg/mL和（26.94±
3.06）pg/mL，与正常对照组和空载体组相比，VEGF表达水平明显下降（P＜0.01）（图3B，表1）。

图 1 重组质粒经酶切后电泳图Fig 1 Electrophoresis result of constructed plasmid pcDNA3.1(-)-hEPO 1: pcDNA3.1(-)-hEPO; 2: pcDNA3.1(-); M:
DL15000Marker.
图 2 pcDNA3.1(-)-hEPO部分测序结果Fig 2 Sequence of eukaryotic expression vectors pcDNA3.1(-)-hEPO
图 3 转染后24 h、48 h各组细胞的EPO（A）和VEGF（B）表达量Fig 3 Expression levels of EPO (A) and VEGF (B) at 24 h, 48 h after transfection*P ＜0.01
表 1 转染后24 h、48 h各组细胞的EPO和VEGF的表达量Tab 1 Expression levels of EPO and VEGF at 24 h, 48 h after transfection(n=3,
Mean±SD)Experimental vs blank or control. *P＜0.01.Group EPO (pg/mL) VEGF (pg/mL)24 h 48 h 24 h 48 h Bla nk 1.77±0.15 2.39±0.22 51.47±3.22 144.01±11.81 Control 1.81±0.18 2.45±0.19 51.77±2.64 140.62±8.03 Experimental 5.00±0.47* 8.73±0.30* 25.68±2.88* 26.94±3.06*
图 4 MTT法检测EPO基因对A549细胞生长的影响Fig 4 The results of proliferation assay of A549 cell lines after pcDNA3.1(-)-hEPO transfection
表 2 三组细胞周期分布及凋亡情况Tab 2 Detection of the percentage of different phase cells and apoptotic rates in three groups (%, n=3,
Mean±SD)Experimental vs blank or control.*P＜0.05;**P＜0.01.Group Cell cycle Total apoptosis G0/G1 phase S phase G2/M phase Blank 46.49±3.78 7.33±1.05 15.53±1.45 0.44±0.26 Control 47.52±4.10 37.98±5.20
15.15±3.05 0.55±0.16 Experimental 45.00±2.02 48.09±1.23* 6.92±1.40*
5.34±1.14**
图 5 PI染色细胞周期及凋亡情况测定Fig 5 Cells were analyzed for different phases and apoptotic rates by PI staining A: Blank group; B: Control group; C: Experimental group.
3 讨论
EPO是细胞因子超家族成员，与促红细胞生成素受体（EPO-R）结合，在红细胞
生成中发挥主要调节作用。

最初认为EPO只在胎肝及成人肾脏中合成，只作用于
红细胞，在贫血患者中起到一定的治疗作用。

但近年来的研究[3]表明许多非造血
器官及组织，如内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞、胎盘等都表达EPO/EPO-R，并且在多种肿瘤中也有不同程度的表达。

因此，EPO是一个多效细胞因子，在机
体内参与广泛的生物学效应发生。

EPO应用于肿瘤治疗是基于其纠正贫血作用。

临床研究[4-8]表明，已研发的rhEPO包括EPO-α、EPO-β和darbepoetin-α能够有效提高肿瘤患者的血红蛋白水平，减少红细胞输注，改善接受治疗的患者的生活质量，在治疗癌症患者贫血中是安全有效的，并且红细胞生成刺激因子（erythropoiesis-stimulating agents, ESAs）可增强肿瘤患者对化放疗的敏感性。

动物研究数据也表明ESAs在纠正贫血的同时可以改善肿瘤机体对化放疗的敏感性，有助于肿瘤的控制。

但与此相反的是，另外一些研究[9,10]则发现ESAs有刺激肿
瘤增生、抑制肿瘤细胞凋亡，使患者生存时间缩短，预后恶化的风险，并且还会导
致肿瘤细胞对化疗药物等的抵抗增加。

其中最引人注意的是一项接受化疗的转移性乳腺癌患者[1]和另两项接受放疗的头颈癌患者[2]使用rh-EPO得到了阴性结果，
不利于肿瘤的治疗。

因此，对于EPO在肿瘤治疗中的作用还有待进一步研究。

研究发现rh-EPO刺激生理性和病理性血管生成，且EPO-R在肿瘤细胞和血管内
皮细胞上表达，提示EPO可能在肿瘤生长和血管生成中起重要作用。

许多研究[11]显示EPO/EPO-R具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞凋亡、促进肿瘤细胞分化、加速肿瘤细胞生长、促进新生血管生成等作用。

Ribatti等[12,13]对肝细胞癌和人神经母细胞瘤研究发现肿瘤细胞分泌EPO以旁分泌形式通过EPO-R促进血管生成，且这种作用与肿瘤中EPO/EPO-R水平成正相关，提示EPO是肿瘤血管生成中的
重要因子。

本研究通过构建EPO真核表达载体，转染人肺腺癌A549细胞，发现转染后
A549细胞生长明显受到抑制且凋亡明显增加，细胞分泌VEGF水平也相应降低。

因此，本研究结果提示EPO可直接抑制A549细胞生长，并且还可以有效抑制VEGF的生成，可能对肿瘤血管的生成有一定的抑制作用。

这与Wollman[14]和Hale等[15]的研究结果相似，表明EPO可通过直接和间接作用抑制A549细胞生长。

然而，临床研究表明EPO对肿瘤细胞的作用有剂量依赖性。

因此，本实验是
否由于EPO的表达水平存在于一定的浓度范围，导致抑制肿瘤生长还有待进一步
研究。

但可以明确的是EPO在一定的浓度范围内不仅可纠正贫血，还可起到有效
抑制肿瘤生长作用。

EPO对不同肿瘤细胞作用不全相同，因此有必要对更多种肿
瘤细胞进行研究，以期为肿瘤个体化治疗原则提供依据。

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