唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定

唾液富组蛋白5的原核表达、纯化与抗菌活性鉴定
金科华
【摘要】设计一对3’端互补、5’端带酶切位点的引物,用PCR扩增唾液富组蛋白5(H5)基因(h5),将我体pGEX4T-2和h5双酶切、连接、转化DH5α,将筛选鉴定的重组质粒pGEX4T-2-h5转化BL21 (DE3).诱导重组菌BL21 (DE3) -pGEX4T-2-h5表达,纯化融合蛋白GST-H5,用Thrombin切去GST标签获取重组H5(rH5),测试rH5抗白色念珠菌(Candida albicans)活性.试验成功构建了重组载体
pGEX4T-2-h5,在37℃重组菌BL21 (DE3)-pGEX4T-2-h5生长至OD600nm=0.6时用1 mmol/L IPTG于20℃诱导9h,可获得高水平表达的融合蛋白GST-H5；酶切后获得的rH5对白色念珠菌生长有较强的抑制作用,rH 5产率约2 mg/L.%The gene of histatin5 (H5) was amplified by a pair of primers with complementary 3' terminal and restriction site in 5' terminal, and was cloned into pGEX4T-2. The recombinant plasmid was transformed into
BL21(DE3); and the expression of soluble fusion protein GST-H5 was induced by 1 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 9 h. The fusion protein was purified by Glutathione-sepharose 4B affinitychromatography and then digested by thrombin to obtain rH5. The results showed that rH5 had strong inhibition againsl Candida albicans. The yield of rH5 was 2 mg/L.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2012(051)008
【总页数】3页(P1696-1698)
【关键词】唾液富组蛋白5(H5);融合蛋白GST-H5;原核表达;白色念珠菌(Candida albicans)
【作者】金科华
【作者单位】湖北科技学院基础医学院,湖北咸宁437100
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
白色念珠菌（Candida albicans，CA）感染严重影响人类健康，常规抗CA药物
毒副作用大，长期使用常规抗CA药物易诱导耐药菌株产生。

唾液富组蛋白5（Histain5，H5）是一种存在于人类唾液中的广谱抗菌肽，由24个氨基酸组成，其中组氨酸7个［1］。

研究表明H5能有效地杀灭耐药的白色念珠菌及其他多种
真菌，毒副作用小，作用机制独特［2］，且不易诱导耐药菌的产生，作为药物防治口腔疾病极具潜力。

此外，H5还具有抑制牙周病相关菌的凝集及其酶活［3］、中和细菌内毒素［4］、诱导肥大细胞释放组胺［5］等功能。

H5功能虽多，但其在人类唾液中含量低，不易分离纯化，得率极低；而化学合成
H5成本高。

这些都限制了H5的研究与应用。

为此，利用基因工程生产H5，以
期为H5的相关研究奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒与引物大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），白色念珠菌，质粒pGEX4T－2 为湖北科技学院基础医学院生物化学教研室保存，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶，Solution I为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA操作相关试剂盒为美国Omega公司产品；限制性内切酶为Thermo fisher scientific 公司产品；Glutathione－Sepharose 4B为通用电气公司产品；Thrombin为Sigma公司产品。

1.2 方法
1.2.1 H5 基因（h5）的 PCR 扩增根据 NCBI公布的h5序列，选用大肠杆菌偏爱密码子设计上游引物 P1：AT GGA TCC GAC TCT CAT GCG AAA CGC CAT CAT GGC TAC AAG CGT AAG TTC CAC GAG；下游引物P2：TA GAA TTC TCA ATA GCC GCG ATG GCT GTG GTG GTT CTC GTG GAA CTT ACG CTT GTA。

粗体序列分别为BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，下划线处为互补区，方框处为终止密码子。

通过P1、P2引物PCR扩增h5。

PCR体系：10 μmol／L P1 4 μL，10 μmol／L P2 4 μL，10×Ex Taq Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，H2O 34.75 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL。

反应参数：95 ℃预变性 3 min；94℃变性 15 s，58℃退火 15 s，72℃延伸15 s，循环30次；72℃延伸5 min。

1.2.2 PCR产物和质粒的双酶切、连接与转化PCR产物h5经纯化后进行酶切，酶切体系：PCR产物h5 20 μL，H2O 30 μL，10×FD Buffer 6 μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各2 μL；反应参数：37℃酶切2 h。

用试剂盒纯化h5的酶切产物。

质粒
酶切体系：pGEX4T－2 6 μL，H2O 44 μL，10×FD Buffer 6 μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各2 μL；反应参数：37℃酶切2 h。

用琼脂糖凝胶电泳分离双酶切后的质粒，胶回收酶切后的质粒，然后连接，连接体系：双酶切后的pGEX4T－2 4 μL、双酶切后的 PCR 产物h5 1 μL，Solution I 5 μL；反应参数：16℃连接 3 h。

取
5 μL 连接产物，采用热击法转化DH5α感受态细胞。

1.2.3 重组质粒pGEX4T－2－h5的鉴定挑取阳性菌落2个，记为1、2，摇菌，
提取质粒并酶切。

用4%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段并进行序列测定。

1.2.4 蛋白质的诱导表达将重组质粒 pGEX4T－2－h5 与空质粒 pGEX4T－2 各0.5 μL 按 1.2.2 的方法转化 BL21（DE3）。

挑含重组质粒 pGEX4T－2－h5及空质粒 pGEX4T－2的 BL21（DE3）单菌落，分别记为 BL21 （DE3）－pGEX4T
－2－h5、BL21 （DE3）－pGEX4T－2，将它们分别接种于2 mL含氨苄青霉素（Amp）的LB培养基中，37℃摇菌过夜，作为种子液。

次晨将种子液接种于
200 mL含Amp的LB培养基中，37℃培养至OD600 nm＝0.6，加入终浓度为
1 mmol／L 的 IPTG，BL21（DE3）－pGEX4T－
2 于37 ℃诱导
3 h 至 OD600 nm＝1.5；BL21 （DE3）－pGEX4T－2－h5分别于37℃诱导 3 h、20℃诱导 9 h 至 OD600 nm＝1.5。

在室温下用13 000 r／min离心5 min，弃上清，加PBS洗涤沉淀2次。

离心，弃PBS，加20 mL PBS重悬菌体沉淀。

以225 W冰
浴超声5 s，间隔10 s，共超声30 min。

于4℃以12 000 r／min离心 5 min。

取上清，用0.8 μm 滤膜过滤，取滤液进行 SDS－PAGE 鉴定。

1.2.5 蛋白质的纯化与酶切分别向10 mL注射器中加 Glutathione－Sepharose
4B 1 mL和方法1.2.4 中诱导 BL21（DE3）－pGEX4T－2 获得的滤液5 mL 以及BL21（DE3）－pGEX4T－2－h5 于20 ℃诱导9 h获得的滤液，于4℃混合2 h，弃去未与琼脂糖结合的蛋白质，用预冷的 100 mmol／L Tris－HCl（pH 7.5）洗涤琼脂糖至流出的洗涤液与Bradford蛋白质测定液反应不显蓝色。

加入含100 U Thrombin的PBS 2 mL，于22℃酶切 6 h。

采用 Tris－Tricine SDSPAGE分析
酶切产物。

1.2.6 测定重组H5（rH5）抗白色念珠菌的活性取对数生长期的白色念珠菌200
μL涂布于沙氏固体培养基上，吸干水分。

分别取融合蛋白GST－H5和GST经Thrombin酶切后的溶液5 μL加于直径5 mm的滤纸片上，于室温晾干后紧贴于固体平板。

以5 μL 1 000、500、200、100、50 μg／mL 的 H5 标准品作为抗菌活性参照，于28℃培养过夜。

2 结果与分析
2.1 H5 基因（h5）PCR 扩增的结果
取5 μL PCR产物进行4%琼脂糖凝胶电泳检测。

由图1可见，PCR产物为80～100 bp，与h5大小相符，表明成功地PCR扩增到了h5。

图1 PCR产物的电泳结果
2.2 重组质粒的酶切鉴定结果
酶切结果见图2，两重组质粒酶切后均产生约80 bp的条带，与h5大小一致，表明h5已成功克隆到pGEX4T－2质粒中。

测序结果证实h5序列无误且读码正确。

2.3 融合蛋白GST－H5诱导表达的结果
BL21 （DE3）－pGEX4T－2 表达 GST 标签（25.7 ku）；BL21 （DE3）－pGEX4T－2－h5 表达出大于 GST的蛋白质，其与融合蛋白GST－H5的分子质
量（29.0 ku）大小相符，且 BL21 （DE3）－pGEX4T－2－h5 在20℃诱导9 h 下产生的融合蛋白GST－H5占总菌体蛋白质的比例显著提高（图3）。

图2 重组质粒的酶切鉴定结果M.20 bp DNA Ladder Marker；1、2.重组质粒pGEX4T－2－h5 BamH I＋EcoR I双酶切后的条带
图3 IPTG诱导蛋白质表达的结果M.蛋白质分子质量标准；1.BL21（DE3）－pGEX4T－2 在37 ℃诱导3 h；2.BL21（DE3）－pGEX4T－2－h5 在37 ℃诱导3 h；3.BL21（DE3）－pGEX4T－2－h5在20℃诱导 9 h
2.4 GST－H5 的酶切结果
GST－H5经Thrombin酶切后得到分子质量为1.7～4.6 ku 的蛋白质条带，与
rH5 的分子质量（3.3 ku）相符，而GST对照组未切出相应条带，表明成功获得
了 rH5（图 4）。

图4 Thrombin切割蛋白质的结果M.蛋白质分子质量标准；1.Thrombin 酶切GST－H5；2.Thrombin 酶切GST
2.5 重组H5（rH5）抗白色念珠菌活性的测定结果
图5 中，1 000、500、200、100、50 μg／mL H5 标准品抑菌圈直径依次为 2.35、1.92、1.65、1.43 和1.18 cm。

重组 H5（rH5）抑菌圈直径为 1.15 cm，GST无抑菌活性。

由此可知，rH5抗菌活性与50 μg／mL H5标准品活性相当。

因此，该2 mL酶切体系中rH5约100 μg，200 mL 诱导体系的 rH5 产率约2 mg／L。

图5 重组H5（rH5）的抗白色念珠菌活性1－5.1 000、500、200、100、50 μg ／mL H5 标准品；6、7.GST、GST－H5的Thrombin酶切产物
3 讨论
为减少重组唾液酸富组蛋白5（rH5）分子中来自pGEX4T－2载体翻译而来的额
外序列对其活性的影响，研究选用载体上的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点酶切载体和设计PCR引物。

但EcoRⅠ酶切位点的选用会导致插入基因无法利用载体上的
终止密码子终止翻译，为此在下游引物中引入一个终止密码子，使h5翻译后立即终止，从而使rH5上的额外序列减少到了最低限度。

预试验测得融合蛋白GST－H5经柱纯化洗脱后的产率为 200 mg／L，rH5 分子
质量（3.3 ku）约占融合蛋白 GST－H5 分子质量（29.0 ku）的 1／9，按完全酶切计算，应获得22.8 mg／L rH5。

而柱上酶切后rH5产率仅2 mg／L，表明酶
切效率低。

可见，酶切效率已成为提高rH5产率的限制因素。

为此更换表达载体、采用不同蛋白酶优化酶切反应条件以提高rH5得率极为重要。

参考文献：
［1］ OPPENHEIM F G，XU T，MCMILLIAN F M，et al.Histatins，a novel family of histidine－rich proteins in human parotid secretion，isolation，characterization，primary structure and fungistatic effects on Candida albicans ［J］.Biol Chem，1988，263 （16）：7472－7477.
［2］ HELMERHORST E J，TROXLER R F，OPPENHEIM F G.The human salivary peptide histatin5 exerts its antifungal activity through the formation of reactive oxygen species ［J］.PNAS，2001，98（25）：14637－14642.
［3］ MURAKAMI Y， TAKESHITA T， SHIZUKUISHI S，et al.Inhibitory effects of synthetic histidine－rich peptides on haemagglutination by Bacteroides gingivalis 381 ［J］.Arch Oral Biol，1990，35（9）：775－777. ［4］ SUGIYAMA K.Anti－lipopoly saccharide activity of histatinspeptides from human saliva ［J］.Experientia，1993，49 （12）：1095－1097. ［5］ SUGIYAMA K，OGINO T，OGATA K.Rapid purification and characterization of histatins （histidine－rich polypetides） from human whole saliva［J］.Arch Oral Biol，1990，35（6）：415－419.。