多柔比星脂质体及其制备方法和用途[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1795867A [43]公开日2006年7月5日
[21]申请号200410097044.7[22]申请日2004.12.21
[21]申请号200410097044.7
[71]申请人台湾东洋药品工业股份有限公司
地址台湾省台北市
[72]发明人陈德容 杨思源 刘嘉宁 黄纯莹 林荣锦
[74]专利代理机构北京三友知识产权代理有限公司代理人丁香兰
[51]Int.CI.A61K 31/704 (2006.01)A61K 9/127 (2006.01)A61P 35/00 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页
[54]发明名称
多柔比星脂质体及其制备方法和用途
[57]摘要
本发明提供一种用以治疗患有胰脏癌之哺乳动
物的多柔比星(doxorubicin)脂质体药物组合物，
以及提供一种制造此种组合物的方法。

200410097044.7权 利 要 求 书第1/1页 1.一种用于治疗患有胰脏癌之哺乳动物的多柔比星脂质体药物组合物，该组合物包含一治疗上有效量的多柔比星脂质体，该组合物的投药量范围为5至15毫克/公斤体重，每周二次。

2.如权利要求1所述的多柔比星脂质体药物组合物，其中该组合物的投药量为10毫克/公斤体重。

3.如权利要求1所述的多柔比星脂质体药物组合物，其中该多柔比星脂质体是利用下述方法制备的：
(a)将一醇类溶剂与包含下述化合物：40-70％二硬脂酰基磷脂酰胆碱、10-35％胆固醇，以及15-30％甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的预混合物组合，以形成一预混合物/醇类溶液，其中预混合物的重量与醇类溶剂的体积之比为约1∶5；
(b)将预混合物/醇类溶液与0.2-0.8N硫酸铵溶液，以约1∶2-10体积比混合，以形成一混合物；
(c)使步骤(b)所得的混合物经过孔径为0.05-0.45μm的孔洞挤压处理，以形成一预脂质体悬浮液；
(d)在室温下，利用5重量％至15重量％蔗糖水溶液，透析该预脂质体悬浮液，以致能获得含有悬浮之脂质体颗粒的脂质体悬浮液；以及 (e)将多柔比星与步骤(d)所获得的该脂质体悬浮液混合。

200410097044.7说 明 书第1/7页
多柔比星脂质体及其制备方法和用途
技术领域
本发明关于多柔比星(doxorubicin)脂质体药物组合物，制造多柔比星脂质体药物组合物的方法，及其用于治疗胰脏癌的用途。

背景技术
在2003年，在美国，约30,000患者死于胰脏癌，以及诊断出约30,700名新病例，使得胰脏癌成为与癌症有关的死亡率的十大最常见原因之一。

对许多患者而言，手术、放射线治疗，以及化学疗法为延续生命及/或减轻症状的治疗选择，但很少治愈(Cancer Facts and Figures，American Cancer Society 2003)。

与非脂质体药物相比较，脂质体药物在静脉注射至动物及人类后，可相当成功地到达原发性肿瘤及抑制其转移，以及显示出较强的治疗效果，以及较轻微的副作用。

最广为发展之脂质体药物之一为多柔比星(d o x o r u b i c i n)脂质体。

在台湾，此药物最常见的品牌名为力得(Lipo-Dox，由台湾东洋药品工业股份有限公司独家制造及销售)，及一类似产品，已知为在美国的都可喜(Doxil)。

多柔比星脂质体常常用于治疗特定的癌症，例如乳癌、卵巢癌，以及一种称为与AIDS相关的卡波西氏(Kaposi's)恶性肿瘤的恶性肿瘤。

对制药工业而言，制备脂质体药物是困难的。

许多用于制备脂质体及/或脂质体药物的方法已被揭露，例如S z o k a教授的发明。

授与Francis C.Szoka，Jr.的美国专利第5,077,057、5,277,914及5,549,910号揭露一种用于制备脂质体悬浮液的方法，该脂质体具有所界定的颗粒尺寸且包封有一有用的化合物，该化合物在水、醇类或卤化烃中的溶解度不佳。

此溶解度不佳的化合物以及足量的适当脂质系溶于例如D M S O(二甲基亚砜)之非质子性溶剂中，若有需要的话，可包含
一溶解量的低级醇类(例如乙醇)，以及接着将混合物经挤压或注射至一经搅拌的水溶液中。

所得的脂质体悬浮液可经透析或浓缩，若有需要的话。

挤压可利用注射筒、多孔盘或任何其它具有约0.05m m至约5m m孔洞尺寸的适当装置来进行。

在此三件美国专利的实施例2中，多柔比星系溶解于DMSO中，并添加含有卵磷脂酰甘油(EPG)：卵磷脂酰胆碱(EPC)：胆固醇(C h o l)(7∶3∶6)的乙醇溶液内。

脂质体系藉由将脂质—多柔比星混合物，在30℃下，注射至一由140mM NaCl-10mM Tris-HCl(pH 4.0)组成的水相中。

将脂质体悬浮液透析，并藉由管柱层析法，将经脂质体包封的多柔比星与未被包封的物质分离。

所得的脂质体的颗粒直径为277 nm，41.2％的多柔比星包封在脂质体颗粒内。

然而，前述方法无法弭除某些问题，例如毒性有机溶剂、无菌条件的维持，以及脂质体的均一性及品质，因此前述方法不适合用于大规模制造。

习知技术已揭露一种利用多柔比星脂质体治疗胰脏癌的方法，例如“评估康利斯(C A E L Y X，多柔比星脂质体，都可喜(D o x i l))在治疗无法切除的胰脏癌之耐受性及功效的第II期研究”(Ann Oncol.2001 Oct；12(10)：1399-402)。

然而，此研究得到CAELYX(多柔比星脂质体，都可喜(Doxil))未见客观反应的结论。

然而，所使用之疗程无法有效地治疗此疾病。

本发明除了提供适于工业制造之制备多柔比星脂质体的方法之外，亦提供利用多柔比星脂质体治疗胰脏癌的方法。

为了评估功效，研究经过及未经过多柔比星脂质体投药之带有胰脏肿瘤的大白鼠的肿瘤尺寸及存活时间。

所有上述文献及专利，以及下文中所提及的文献，皆全文并入本说明书中以供参考。

发明内容
因此，本发明的一个目的是提供多柔比星脂质体药物组合物以及有效地使用此组合物来治疗胰脏癌。

在一方面，本发明提供一种治疗患有胰脏癌之哺乳动物的方法，包含投药治疗上有效量的多柔比星脂质体药物组合物的步骤。

在另一方面，本发明提供一种制造多柔比星脂质体药物组合物的方法。

附图说明
图1显示力得(Lipo-Dox)对带有AR42J胰脏肿瘤之大白鼠在肿瘤体积方面的效果；以及
图2显示力得(Lipo-Dox)对带有AR42J胰脏肿瘤之大白鼠在存活时间方面的效果。

具体实施方式
本发明之较佳实施例的详细说明
本发明提供一种制造多柔比星脂质体的方法，包含下述步骤：(a)在约55-65℃下，提供包含下述化合物之预混合物：40-70％二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、10-35％胆固醇，以及15-30％甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)与一醇类溶剂之预混合物/醇类溶液，其中该预混合物的重量与醇类溶剂的体积之比为约1∶5，所述醇类优选为低级醇，例如甲醇、乙醇和丙醇；(b)将预混合物/醇类溶液与0.2-0.8N硫酸铵溶液(优选0.2N硫酸铵溶液)，以约1∶2-10的体积比混合，以形成一混合物；(c)在50-70℃下，较佳为在60℃下，使步骤(b)所得的混合物经过0.05-0.45μm之孔径的孔洞挤压处理，以形成一预脂质体悬浮液；(d)在室温下，利用5重量％至15重量％蔗糖水溶液，透析该预脂质体悬浮液，以致能获得脂质体悬浮液；以及(e)在55-65℃下，较佳为在60℃下，将多柔比星与步骤(d)自蔗糖水溶液所获得的该脂质体悬浮液混合。

当与习知方法比较时，本发明可在低压下(约40至140p s i)下进行，但得到较高的产率(约2至10L/m i n)，其比在约100至200p s i 下进行且产率为1至5L/min的习知方法好。

本申请人已经在2003年7月7日以“脂质体悬浮液制造方法及其产物”为发明名称，在大陆提交发明专利申请，申请号为03178458.5，其中详细地描述了力得(Lipo-Dox)的制备方法及组成，该申请的内容也作为本发明的一部分。

利用力得(Lipo-Dox)，以静脉注射(I.V.)的方式治疗患有胰脏癌的大白鼠，剂量为10mg/kg。

结果显示于下述说明中。

经过生理食盐水或力得(Lipo-Dox)投药后，体重、肿瘤尺寸及存活时间的改变显示于表1及2中。

图1显示在投药剂量为10m g/k g生理食盐水(对照组)或力得(Lipo-Dox)后，相对肿瘤体积随着时间的改变。

治疗是在将肿瘤植入大白鼠后第0天及第13天开始。

大白鼠是在第0、3、7及10天时，利用生理食盐水或力得(Lipo-Dox)(10mg/kg)治疗。

依所指定的天数测量肿瘤。

以V t/V0指数表示相对肿瘤体积，其中V t为所指定天数的肿瘤体积，以及V0为治疗开始时同一肿瘤的体积。

图2显示在投药剂量为10m g/k g生理食盐水(对照组)或力得(Lipo-Dox)后，大白鼠的存活时间。

治疗是在将肿瘤植入大白鼠后第0天及第13天开始。

大白鼠是在第0、3、7及10天时，利用生理食盐水或力得(Lipo-Dox)(10mg/kg)治疗。

表1 于经过或未经过力得(L i p o-D o x)治疗后，体重的改变编号体重(g)
注射前注射后
3天7天10天14天17天21天24天
生理食盐水
组303 308180
180
180
180
220
240
230
225
死亡
240
死亡
死亡
死亡
死亡
死亡
死亡
力得
(LIPODOX)组304
305
311170
180
160
180
190
170
170
180
170
120
120
120
110
110
110
110
110
110
110
110
110
110
110
110
表2于经过或未经过力得(Lipo-Dox
)治疗后，肿瘤体积及存活时间的改变 注：在表1和表2中，生理食盐水组中的编号“303”和“308”代表两个具有相同浓度的重复对照组，力得组中的编号“304”、“305”和“311”代表组成和含量相同的三个重复实验组，
当在第0、3、7及10天静脉注射时，力得(L i p o -D o x )对抗皮下(s.c.)植入的A R 43J 胰脏肿瘤是高度有效的。

在10m g /k g 的剂量下，所有动物皆治愈，以及经治疗的大白鼠的存活率呈现增加(参见图1及图2)。

于经由静脉注射四次投药生理食盐水后，大白鼠的体重稳定地增加，然而，利用力得(Lipo-Dox
)治疗的大白鼠之体重呈现下降高达33.33百分比。

此结果可得到下述结论：力得(Lipo-Dox
)的投药为胰脏癌的有效治疗方法。

实施例
下述实施例例示说明制备、特性描述及使用本发明之组合物的方法。

此等实施例并非意欲限制本发明之范围。

编号
肿瘤体积(mm 3)
减少或增加％反应存活时间(d)
注射前注射后3天
7天10天生理食盐水
组
303
308397.55
595.73
2771.723934.756885.527601.6411258.2612050.18增加391.92％增加291.11％不良不良13
15力得(Lipo-
Dox)组
304
305
311774.04
785.7
727.59
1195.91671.621139.37318.21338.2397.89000减少100％减少100％减少100％良好良好良好262727
将16.8克之PEG-2000-DSPE(购自Genzyine Co.，美国)、27.4克之胆固醇(购自N O F C o.，日本)以及38.2克之D S P C(购自N O F C o.，日本)添加至玻璃容器内之600毫升乙醇中。

在60℃下使混合物混合良好。

当持续地搅拌混合物并将混合物维持在60℃时，将4升0.2N的硫酸铵水溶液添加至混合物中。

在此温度下，乙醇几乎全部蒸发。

对混合物进行孔洞挤压处理，使用1.5升的滤膜(购自Toyo Kaisha，Ltd.，日本)。

孔洞挤压处理包含：
(1)使用第一过滤膜(142毫米，0.1微米)，将混合物过滤10次；以及
(2)使用第二过滤膜(142毫米，0.05微米)，将混合物再过滤10次。

挤压压力保持在3至10公斤/平方公分，以及流速为约2至10升/分钟。

收集4500毫升滤液并接着利用30升9重量％的蔗糖溶液以30K D 中空纤维(A/G Technology，UFP-30-C-6A，30,000NM，4800平方公分)透析。

残留的乙醇藉由透析去除。

所收集的溶液的体积约3000毫升，以及所收集的溶液为不含有乙醇的脂质体悬浮液。

将所制造之3000毫升的脂质体悬浮液添加至含有8000毫克多柔比星盐酸盐(红色粉末)的玻璃容器中，接着持续地添加预先制备的200毫升含有0.8-1.2N(优选0.9N)的组氨酸的蔗粉溶液(组氨酸—蔗粉溶液)，蔗粉溶液的浓度为0.9重量％。

将混合物置于60℃的水浴中并搅拌30分钟，接着冷却至约35℃，利用9％的蔗糖溶液稀释至4升，并混合良好。

将产物包装在用于作为可注射制剂的无菌玻璃小管瓶中，该制剂包含2.0毫克多柔比星盐酸盐/毫升。

实施例2 制备AR42J细胞悬浮液
衍生型且为重氮丝氨酸引发之大白鼠胰脏肿瘤的A R42J细胞株(ATCC，CRL 1492)购自ATCC。

在37℃下以及95％氧气及5％二氧化碳的湿度环境下，将AR42J细胞培养在Ham’s F-12K(Gibco BRL)培养基中，该培养基含有20％胎牛白蛋白、2m M之L-谷氨酰胺，以及1.5克/
升的碳酸氢钠。

细胞例行地以1×106浓度培养在T-烧瓶中。

藉由主要培养，利用胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL)收取藉由细胞，以及在1000rpm下离心细胞悬浮液10分钟，并调整至1×107细胞/毫升。

使用锥虫蓝(Trypan blue)来评估AR42J胰脏肿瘤细胞的生命力。

实施例3 植入AR42J胰脏癌细胞
使用5只路易士大白鼠(Lewis rats，由台湾国家科学会提供)来进行实验，每只大白鼠重约160克至180克，以及所有大白鼠皆约3周大。

食物及水无限制地供给。

动物照料及利用程序根据原子能研究委员会的实验室动物的照料及利用指引(G u i d e f o r t h e C a r e a n d U s e o f Laboratory Animals from the Institute of Nuclear Energy Research)。

将一百万个AR42J细胞悬浮在0.1毫升培养基中，并皮下注射至大白鼠的右下肢。

植入二周后，藉由公式：长度(毫米)×宽度2(毫米2)/ 2，估算肿瘤体积。

V t/V0指数表示相对肿瘤体积，其中V t为在所指定的天数测量的肿瘤体积，以及V0为在测量开始时同一肿瘤的体积。

实施例4 投药力得(Lipo-Dox)的治疗效果
将带有AR42J胰脏肿瘤的大白鼠分为二组，其中二只大白鼠为对照组，以及另外三只为力得(Lipo-Dox)组。

给此二组的大白鼠分别喂食生理食盐水或力得(Lipo-Dox)，投药量为5至15毫克/公斤，较佳为10毫克/公斤)，每周二次(在星期三及星期六)，共静脉注射四次。

在投药后需立即小心地观察，例如肿瘤体积、体重、活动力程度，以及毛发掉落情况，并监测直至没有大白鼠存活。

虽然本发明已连同所谓最佳具体实施例来说明，但应了解到，本发明并不限于上述的具体实施例，且意欲涵盖包括于本发明之最广解释的精神及范围中的任何不同的改良。

200410097044.7说 明 书 附 图第1/2页
图1
200410097044.7说 明 书 附 图 第2/2页
图2
11。