猪肠道粘膜胞内劳森氏菌的分离与检测

猪肠道粘膜胞内劳森氏菌的分离与检测
尹会方;杨小燕;张新平;郑新添;林志;黄伟彬
【摘要】通过对猪增生性肠炎阳性病例肠粘膜进行处理、过滤、分离出胞内劳森氏菌,分别运用抗酸染色、Giemsa染色、银染和PCR检测,并设增生性肠炎弱毒疫苗为阳性对照。

结果表明,在显微镜下都能观察到这三种不同染色方法染色的胞内劳森氏菌,且PCR检测均为阳性,与弱毒疫苗阳性对照结果一致。

结论：成功分离并鉴定出劳森氏菌,为进一步研究其培养特性和病原学研究奠定了基础。

%In this paper,L.intracellularis was isolated from processing the intestinal mucosa of porcine proliferative enteritis and filtering material.Acid-fast staining,Giemsa staining,silver staining and PCR were used to detect
L.intracellularis and proliferative enteritis attenuated vaccine was detected as a positive control.The results show that L.intracellularis using these different staining methods can be observed under the microscope and PCR identified as a positive control.The conclusion is that we successfully isolated and identified L.intracellularis,which lays a foundation for further study of its cultural characteristics and etiological research.
【期刊名称】《龙岩学院学报》
【年(卷),期】2012(030)005
【总页数】6页(P55-60)
【关键词】胞内劳森氏菌;分离;检测
【作者】尹会方;杨小燕;张新平;郑新添;林志;黄伟彬
【作者单位】龙岩学院,福建龙岩364012 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心龙岩中心,福建龙岩364000;龙岩学院,福建龙岩364012 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心龙岩中心,福建龙岩364000;福建农林科技大学,福建福州350002;龙岩学院,福建龙岩364012 福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心龙岩中心,福建龙岩364000;龙岩学院,福建龙岩364012;龙岩学院,福建龙岩364012
【正文语种】中文
【中图分类】S851.3
猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteropenthy,PPE）是由胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis,LI）引起的一种接触性肠道传染病。

临床主要表现为腹泻、贫血、食欲下降和生长缓慢等。

病理剖检可见回肠、盲肠及结肠前1/3部高度增生为特征。

显微变化以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为特征。

[1]PPE主要发生在6～20周龄的生长肥育猪，成年公母猪也有发生，很多呈隐性感染，并可作为传染源。

LI还感染仓鼠、大鼠、兔等杂食动物；雪貂、狐等肉食动物；马、鹿等草食动物和鸵鸟、鸸鹋等鸟类。

[2]LI菌体呈小弯曲形、逗点形、S形或杆状，两端尖或圆钝，大小为（1.25～1.75）μm×（0.25～0.43）μm；该菌能通过0.65 μm的滤膜，不能通过0.22 μm的滤膜，具有波状的3层膜作外壁，无鞭毛，无柔毛，无运动力。

LI革兰氏染色阴性；抗酸染色阳性；改进的Warthin-Starry银浸染技术可取得较好的着色效果；Modified Ziehl-Neelsen染色，细菌被染成红色。

[3]在常规条件下培养LI迄今还没人获得成功，它的生长需要附着在上皮细胞，获能取自于宿主细胞，所以在没有细胞的培养基中不能生长。

该菌属微嗜氧，在8%含氧量中存在最佳；在二氧化碳为 5%的环境中
即可；[4，5]在5～15℃离体环境中菌体可以存活1～2周。

[6]本文将研究LI的
分离纯化方法，应用抗酸染色、Giemsa染色、银染、PCR对其进行检测，并获得其纯处理物，为进一步研究LI的人工培养和实验室诊断PPE奠定了基础。

1 材料
1.1 病料
龙岩学院动物医学研究所接诊患有PPE临床症状的猪肠道粘膜。

1.2 试剂
石碳酸复红液、3%盐酸酒精、亚甲基蓝液购自：安徽省巢湖市弘慈医疗器械有限
公司；Giemsa姬姆萨染色液试剂购自：江苏省南京凯基生物科技发展有限公司；
0.1%Trypsin（0.1%胰酶）购自：广州英韦创津生物科技有限公司；10%胎牛血
清（FCS）购自：杭州四季青生物工程有限公司；PCR试剂盒购自：广州东盛生物有限公司。

1.3 配制试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）：0.2 mol/L 磷酸二氢钠与0.2 mol/L磷酸氢二钠按体积比39:61混匀，pH 调至 7.0；蔗糖磷酸盐谷氨酸钠盐（sodium potassium glutamate，SPG）：把蔗糖75.00 g、磷酸二氢钾0.52 g、磷酸氢二钠1.22 g、谷氨酸0.72 g溶于 1000 mL蒸馏水，调 pH 至 7.4～7.6；银染固定液：冰醋酸
与蒸馏水按体积比1∶9混匀，即10%冰乙酸；银染染色液：将0.1 mL硝酸银与0.15 mL甲醛混匀，再加蒸馏水至100 mL；银染显色液：将 3 g氯化钠、0.15 mL甲醛、0.01 g硫代硫酸钠装进烧杯，再加蒸馏水至100 mL；银染终止液：冰醋酸与蒸馏水按体积比1∶19混匀，即5%冰乙酸。

1.4 疫苗
猪回肠炎弱毒疫苗购自：勃林格殷格翰动物保健有限公司。

2 方法与步骤
2.1 猪肠道粘膜PCR检测
取患有增生性肠炎典型症状的疑似病例，刮取回肠黏膜，匀浆，室温750 g离心
10 min，上清分别用 5、1.2、0.8 μm 的滤膜过滤，取滤液，8 000 g离心10 min，弃上清，沉淀用PBS悬浮即得到PPE感染滤液。

在1.5 mL离心管中加入
50 μL的 20%硅藻土悬浮液（用 0.17 mol/L HCL 配制）、50 μL PPE 感染滤液，并加入950 μL的裂解液，震荡混匀。

室温放置10 min，混匀后14 000 g离心
20 s，弃上清，沉淀用 5.5 mol/L 的GuSCN 及 0.15 mol/L 的 Tris.CL（pH6.4）洗涤2次，并用70%的预冷乙醇洗涤2次，丙酮洗涤1次。

置56℃干燥15 min，沉淀用PCR buffer溶解，4℃保存。

根据GenBank中的胞内劳森氏菌基因序列NM204571和 AM180252，应用软
件 Primer5.0分别设计一对特异性引物（见表1），预期扩增片段长度为160 bp
和210 bp，引物由上海生工生物技术有限公司合成，所合成引物用ddH2O稀释
为20 pmol/μL，-20℃保存备用。

表1 胞内劳森氏菌扩增引物引物名称引物序列P1 P2扩增长度5＇-AGACGCCCTTCTCAACT-3'5＇-ACTTCCCAACCATCAAC-3'P3 P4 160 bp 5’-GCAGCACTTGCAAACAATAAACT-3’5’-TTCTCCTTTCTCATGTCCCATAA-
3’210 bp
PCR反应体系和反应条件如下：10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL；P1（20 pmol/μL）1 μL；P2（20 pmol/μL）1 μL；模板3 μL；EX Taq
酶（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O 16 μL；总体积25.0 μL。

将PCR各组份加入离心
管中瞬时离心混匀，在PCR仪上执行以下程序：94℃预变性 5 min；94℃变性
30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。

同时以去离子水代替模板做空白对照。

取5 μL PCR产物在1% 琼脂糖凝胶中电泳检测PCR扩增结果。

2.2 胞内劳森氏菌的分离
取增生性肠炎PCR阳性的猪回肠一段（长约3 cm），剖开，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。

将1 g粘膜刮入 SPG 中，然后用 4.0 mL 0.1%Trypsin在SPG中均化30 s。

接着把悬浮液放在37℃水浴锅孵育25 min。

之后加入10 mL SPG含10%胎牛血清（FCS），然后在组织研磨器上研磨1 min。

再加入10 mL SPG含10%FCS，然后用过滤纸过滤一次，随后用 5.0、1.0 和0.65 μm 过滤膜上过滤。

将滤液分成数份，按1.0 mL一份储藏于-70℃。

2.3 抗酸染色检测
将1～2滴滤液滴加到载玻片上形成涂片，待涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片与火焰间距保持10 mm以上的距离，火焰固定（在5s内将玻片置于火焰上
烤4次）。

滴加石炭酸复红染色液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 min。

染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。

加温时勿使染色液沸腾。

然后，流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。

自痰膜上端外缘滴加3%盐酸酒精脱色剂布满痰膜，脱色1 min；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。

流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。

滴加亚甲基蓝染液，染色30 s。

流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。

2.4 姬姆萨染色检测
待涂片自然干燥后，平置涂片与染色架上，滴加Giemsa染色液试剂一3～5滴，使其迅速覆盖整个涂片，染色1 min，以固定涂片。

接着，直接往涂片上滴加Giemsa染色液试剂二6～8滴，轻摇玻片或用洗耳球对准涂片吹气使染液充分混合，染色 5～8 min。

最后，水洗涂片 30 min，待玻片干后镜检。

2.5 银染检测
待涂片自然干燥后，将涂片平置在染色架上，滴加银染固定液10%冰乙酸覆盖整
个涂片3 min，然后用蒸馏水脱洗3 min，待涂片干燥后，滴加染色液固定5 min，接着用蒸馏水脱洗1 min，继续等待涂片干燥，滴加显色液5 min后用蒸馏水脱
洗1 min，最后等待涂片干燥滴加终止液5%冰乙酸3 min，用吸水纸吸干玻片，待玻片干燥后镜检。

2.6 肠道粘膜分离产物PCR检测
在 1.5 mL离心管中加入50 μL的 20%硅藻土悬浮液（用 0.17 mol/L HCL 配制）、50 μL PPE感染滤液，并加入950 μL的裂解液，震荡混匀。

室温放置
10min，混匀后14000g离心20 s，弃上清，沉淀用5.5 mol/L的 GuSCN及
0.15 mol/L的 Tris.CL（pH6.4）洗涤 2 次，并用 70%的预冷乙醇洗涤2次，丙
酮洗涤1次。

置56℃干燥15 min，沉淀用PCR buffer溶解，4℃保存。

PCR反
应体系和反应条件同步骤2.1。

3 结果与分析
3.1 症状与病变
带有PPE的猪肠系膜淋巴结肿大，剖开可见肠内充满未消化的饲料。

回肠、小肠
后部、结肠前部和盲肠的肠壁形成假膜，肠壁增厚和直径增加。

病猪回肠有脑回样病变，形成皱褶（图1）。

结肠有胶样渗出和带血粪便。

有时可见小肠带有凝血块（图2）。

3.2猪肠道粘膜和肠道粘膜分离产物的PCR检测结果
图1 回肠粘膜增厚
图2 回肠出血增生
患有典型猪增生性肠炎临床症状的肠道粘膜产物PCR电泳分别出现大小在210
bp和160 bp左右条带（图3），与预期的胞内劳森氏菌目的DNA片段大小相符，可以确诊该病例为增生性肠炎阳性病例，因此，可以从该病例肠道粘膜进行LI病
原分离。

肠道粘膜分离产物PCR产物电泳也出现大小在210 bp和160 bp左右
条带，与预期目的DNA条带大小相符，可以确定该处理物PCR阳性。

综合检测结果，可以确定该分离物中含有实验所需的LI病原（图4）。

图3 肠粘膜DNAPCR扩增图1，2：阴性样品；3：（p1/p2 引物），4：
（p3/p4引物）为肠粘膜样品；M：DL2000
图4 肠粘膜处理物PCR扩增图1-4：分离物扩增产物；5-6：疫苗阳性对照扩增产物；7，阴性对照；M：DL2000；2，4，6 ：p1/p2 引物；1，3，5：p3/p4 引物
3.3 抗酸染色检测结果
对增生性肠炎PCR阳性肠粘膜处理物进行抗酸染色，在100倍油镜下观察，可见肠粘膜处理物中有染成红色的细菌（图5），与疫苗对照染色视图一致（图6）；其他细菌和细胞均可染成蓝色，初步确定该分离物中含有LI病原。

图5 过滤处理液抗酸染色图（1000×）
图6 疫苗对照抗酸染色图（1000×）
3.4 Giemsa染色检测结果
该肠粘膜处理物用Giemsa染色，在油镜下观察可看到被染成浅红色的细菌（图7），该菌体形状和与疫苗对照染色视图一致（图8）。

图7 肠粘膜处理物Giemsa染色图（1000×）
图8 疫苗对照Giemsa染色图（1000×）
3.5 银染检测结果
该肠粘膜处理物用银染检测，在显微镜下见到被染成银黑色的细菌(图9)，该菌体形状和疫苗对照染色观察到的细菌形态一样（图10），进一步确定该分离物中含有LI病原。

图9 肠粘膜处理物银染图（1000×）
图10 疫苗对照银染图（1000×）
4 讨论
4.1 猪增生性肠炎的发生是由于胞内劳森氏菌侵害猪回肠和大肠前段连接处的粘部分的肠腺窝细胞和未成熟的上皮细胞，被感染的细胞很难成熟而且持续进行有丝分裂，引起旺盛的细胞增生，从而导致肠壁增厚，同时，由于机体的代偿和修复作用，使病变重叠发生，随着表面纤维化反应的延伸及向纵深发展，导致坏死性肠炎病变。

[7，8]本文研究的病例都具有非常典型的临床症状与病理变化，并参照J·P·克尼特尔等[4]描述的方法进行LI的分离。

4.2 对于LI染色比较的具体报道非常少，本文根据LI的病原特征，参照Guedes
R[9]采用银染技术、抗酸染色或Giemsa染色法对病变粘膜涂片染色，是证实劳森氏菌的存在最为简便的诊断方法，[9]选用抗酸染色、W-S银染和Giemsa染色等方法进行比较研究。

引起猪增生性肠炎的胞内劳森氏菌是抗酸杆菌，抗酸杆菌菌体含有大量的类脂，石炭酸复红在类脂中的溶解度高于酸性酒精，所以不能被酸性酒精脱色，其他细菌脂类含量少，可以被酸性酒精脱色，因此，在显微镜下看到的胞内劳森氏菌被染成红色；Giemsa，染色法简便、检验速度快（30 min）、价廉，其缺点是易褪色，不能长期保存。

W-S银染银染颗粒沉淀在细菌上，与组织对比
明显，观察较容易，照片效果好，但该法视野中有时沉积的银化合物多，混入其中的细菌不好观察，还存在操作耗时(>1 h)、试剂昂贵(一次性染液)并要现配、需要水浴、对染色技术要求较高(试剂不稳定时可严重影响实验结果)等不足。

刘莉[10]，杨江辉[11]等对幽门螺杆菌进行三种染色方法比较发现这几种染色检测方法无明显差异。

本研究采取银染技术、抗酸染色或Giemsa染色法对PCR阳性猪肠粘膜以
及肠粘膜处理物进行染色检测，并与勃林格劳森氏菌疫苗阳性对照进行比较，结果显示这三种方法都能观察到分离的胞内劳森氏菌，根据染色效果比较发现这三种染色方法中抗酸染色、W-S银染染色效果好于Giemsa染色效果。

4.3 PCR检方法因具有特异、敏感、重复性好等特点而经常应用于病原的检测[12]，
PCR检测方法的敏感性极易受样品处理的回收率和样本中PCR抑制因子的影响。

[13]董炳梅等[12]建立胞内劳森氏菌PCR检测方法的最低检测率达到
1.7×102copies/μL。

本文从 PCR 阳性 PPE 病例肠粘膜采集病料、经过一系列的处理、纯化，最终得到纯化的处理物且PCR结果也是阳性。

本试验分离PPE阳性肠粘膜LI病原，通过几种染色检测和PCR检测，结果显示成功分离出胞内劳森氏菌，为进一步研究其培养特性和病原学研究奠定了基础。

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