阿奇霉素对哮喘患者诱导痰中细胞因子的影响

阿奇霉素对哮喘患者诱导痰中细胞因子的影响
朱柠;何剑;陈小东
【摘要】目的评价阿奇霉素对支气管哮喘患者诱导痰中细胞因子的影响及其安全性.方法本实验40例哮喘患者,随机分为阿奇霉素联合吸入性糖皮质激素(inhaled cortisteroid,ICS)加长效β2-肾上腺素受体激动剂(long-acting β2-agonists,LABA)组(A组)和ICS加LABA组(B组),治疗12周后,用ELISA检测患者治疗前后诱导痰中细胞因子IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ的浓度变化,并评估阿奇霉素治疗的不良反应.结果治疗12周后,两组患者的哮喘诱导痰细胞因子的浓度明显下降,差异有统计学意义;A组诱导痰标本内细胞因子浓度较B组明显下降,差异有统计学意义;两组均未出现严重的不良事件.结论阿奇霉素联合ICS和LABA治疗哮喘安全有效,可有效降低气道炎症反应程度,调节Th1/Th2平衡.%Objective To evaluate the impact of azithromycin on cytokines and its safety in the treatment of asthma. Methods Forty patients with asthma were randomized equally into two groups, of which group A received azithromycin combined with inhaled cortisteroid (ICS) plus long-acting β2-agonists (LABA) for 12 weeks, and group B received only ICS plus LABA. We evaluated the cytokines in induced-sputum including IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α and IFN-γ, and the adverse reaction of azithromycin. Results After 12 weeks, the concentrations of IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-γ and TNF-α in induced-sputum were reduced significantly in both groups. Compared with group B, the decline of cytokines in induced-sputum was much more significant in patients of group A. No severe adverse events were found in either groups.Conclusions Azithromycin
combined with ICS plus LABA is an effective and safe treatment for asthma, which can significantly reduce the level of inflammatory activity and regulate the balance of Th1/Th2.
【期刊名称】《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2011(038)001
【总页数】4页(P22-25)
【关键词】哮喘;阿奇霉素;诱导痰;细胞因子;吸入性糖皮质激素;长效β2-肾上腺素受体激动剂
【作者】朱柠;何剑;陈小东
【作者单位】复旦大学附属华山医院呼吸科,上海,200040;复旦大学附属华山医院呼吸科,上海,200040;复旦大学附属华山医院呼吸科,上海,200040
【正文语种】中文
【中图分类】R453.3;R562.2+5
近年来的研究表明,新大环内酯类抗生素如阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等,除有抗菌作用外,还可通过影响白细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的细胞因子分泌,或者直接作用于多种细胞因子来抑制炎症介质的释放、降低气道反应性、进行免疫调节,从而发挥类激素样作用[1-2]。

Williams等[3]的体外实验研究证实,克拉霉素可以影响IL-4和IL-4/IFN-γ的表达,调节Th1/Th2平衡。

另一项试验[4]结果显示,克拉霉素联合ICS用于难治性哮喘的治疗,可以降低患者气道IL-8水平,减轻气道内中性粒细胞的聚集和活化。

一项临床试验[5]入选278例近24 h内哮喘急性发作的患
者,随机分为泰利霉素组或安慰剂组,结果显示泰利霉素较安慰剂可以有效地减轻哮
喘症状,延长无症状时间,改善肺功能。

因此,本试验将小剂量阿奇霉素联合吸入性糖皮质激素(inhaled cortisteroid,ICS)加长效β2-肾上腺素受体激动剂(long-acting β2-agonists,LABA)用于治疗支气管哮喘,以探讨其对支气管哮喘患者诱导痰中细胞因子的影响。

资料和方法
材料与仪器布地奈德干粉吸入剂(普米克都保,英国阿斯利康公司)100μg/剂;福莫特罗干粉吸入剂(奥克斯都保,英国阿斯利康公司)4.5μg/剂;沙丁胺醇气雾剂(万托林气雾剂,美国葛兰素史克公司)100μg/剂;阿奇霉素片(希舒美,美国辉瑞公司)0.25 g/片;10%氯化钠溶液 10 mL/支;二硫苏糖醇(DTT);人 IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、TNF-α、IFN-γ的ELISA试剂盒(美国UCL公司);MRⅢ型酶标仪(美国Hyperion
公司);肺功能测定仪Master Screen(德国Jaeger公司);雾化吸入机(德国PARYBOY公司)。

研究对象入选标准:符合2006年版全球哮喘防治创议(Global Intitiave for Asthma,GINA)的诊断标准[6],年龄18～65岁,支气管哮喘中度持续。

排除标准:急性呼吸道感染,慢性气道疾病,慢性心脏、肝、肾、糖尿病、结缔组织病等严重疾病,妊娠,入选前1个月内使用过糖皮质激素及其他抗炎药,吸烟量＞5包/年。

选择40例确诊的支气管哮喘患者,临床特征均为未控制(中度持续);其中男性17例,女性23例,年龄范围22～52岁,平均年龄(35±7.3)岁。

健康对照组20例,年龄27～42岁,平均年龄(34±5.6)岁,无急慢性呼吸道疾患和吸烟史,无慢性心、脑、肝、肾等疾病。

试验方案本实验采用随机对照的研究方法,随机数字通过随机数字表产生。

2007
年 3月至2008年6月于我院门诊选择40例哮喘患者,所有患者均签署了知情同意书;40例患者随机分入A、B组,每组20例;正常对照组(C组)20例。

A组:阿奇霉素 0.25 g/次,2次/周;布地奈德200μg/次 ,2 次/天;福莫特罗4.5μg/次,2 次/天 ;必要时吸入万托林,疗程12周;B组:布地奈德200μg/次,2次/天 ;福莫
特罗4.5μg/次,2 次/天;必要时吸入万托林,疗程12周;C组:正常对照组。

诱导痰标本收集使用梯度高渗盐水法,使用前配制3%、4%、5%高渗盐水和
0.1%DTT。

诱导痰标本收集操作方法:(1)诱导前10 min让患者吸入沙丁胺醇
400μg;(2)雾化前清水漱口、擤鼻;(3)3%高渗盐水超声雾化吸入15 min,用力咳痰
至50 m L刻度离心管内;(4)若第(3)步后患者无痰或痰量不足,则换用4%高渗盐水
继续雾化7 min;(5)若第(4)步后患者无痰或痰量不足,则换用5%高渗盐水继续雾化,7 min后终止诱导程序;(6)加入4倍体积0.1%的DT T充分混合,快速震荡15 s,37℃水浴10 min;(7)2500 r/min离心10 min,收集上清液于-70℃冰箱保存待测。

诱导痰细胞因子浓度检测使用人IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13 、TNF-α、
IFN-γ检测试剂盒诱导痰内细胞因子浓度,严格按照试剂说明书操作。

观察指标阿奇霉素治疗前后各组患者诱导痰内炎症细胞因子 IL-4、IL-5、IL-8、
IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ及 IL-4/IFN-γ变化及治疗过程中的不良事件。

统计学方法采用SPSS 15.0软件进行统计学处理,数据以表示,组内采用配伍组设
计资料的方差分析,组间采用完全随机设计资料的方差分析,不同组不同时间完全随
机设计资料的方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
治疗前资料和评估入选患者中男性17例,女性23例;入选年龄 22～52岁,平均年
龄(35±7.3)岁;健康对照组中男性10例,女性10例,入选年龄25～48岁,平均年龄(34±5.6)岁(表1)。

哮喘患者随机分入A组或B组。

治疗前A组与B组间临床指
标无明显差异,包括:ACT评分,FEV1和FEV1/FVC,其对应的 P值分别为
0.402,0.251,0.658,差异无统计学意义(表1);而A或B组与C组相比,各临床指标的P值均＜0.05,差异有统计学意义。

治疗前,A或B组与C组相比,各细胞因子浓度及
IL-4/IFN-γ比较,P值均＜0.05,差异有统计学意义;A组与B组间各细胞因子浓度及IL-4/IFN-γ比较,P值均＞0.05,差异无统计学意义(表2)。

表1 各组患者治疗前的基本资料Tab1 Basic characteristic of each group before treatment?
表2 各组诱导痰细胞因子浓度治疗前后比较Tab2 Comparision of each group for cytokines in induced-sputum between before and after treatment
(,pg/mL)Result Group A Group B Group C Baseline 12 week later P value Baseline 12 week later P v alue Baseline 12 week later P value IL-4(pg/mL) 475.16±48.74166.78±14.47 ＜0.05476.06±49.78227.79±18.52 ＜
0.05132.37±84.39117.74±25.1 ＞0.05 IL-5(pg/mL)
316.39±36.30147.40±15.69 ＜0.05313.88±34.96198.86±19.26 ＜
0.05127.33±20.34123.87±31.22 ＞0.05 IFN-γ(pg/mL)
787.81±58.91398.13±26.31 ＜0.05845.80±52.53508.82±31.45 ＜
0.05475.23±8.77453.23±10.13 ＞0.05 TNF-α(pg/mL)
167.62±13.05147.56±15.58 ＜0.05166.14±12.96142.14±12.81 ＜
0.0587.34±8.2783.71±7.91 ＞0.05 IL-13(pg/mL) 157.59±18.3093.92±10.41 ＜0.05156.26±16.9880.64±8.38 ＜0.0577.91±3.2375.37±2.86 ＞0.05 IL-
10(pg/mL) 44.38±4.9632.73±3.77 ＜0.0543.10±4.3731.73±3.50 ＜
0.0515.39±0.8415.22±1.23 ＞0.05 IL-8(pg/mL) 54.41±3.8237.24±2.49 ＜0.0554.27±3.6628.93±2.02 ＜0.0516.94±1.3316.11±2.07 ＞0.05 IL-4/IFN-γ 0.60±0.030.39±0.05 ＜0.050.58±0.060.44±0.06 ＜0.050.28±0.070.26±0.04 ＞0.05
治疗后评估 12周治疗结束后,A、B组诱导痰中细胞因子的浓度均较治疗前有明显降低,P值均＜0.05。

治疗后诱导痰细胞因子情况:A组与B组相比:IL-4、IL-5 、IL-
8、IL-13、IFN-γ和 IL-4/IFN-γ,P值均＜0.05,差异有统计学意义;IL-10和 TNF-α,P值均＞0.05,差异无统计学意义。

A、B组与C组相比,P值均＜0.05,差异有统计学意义(表2)。

不良反应依据美国国立癌症研究所制订的通用药物毒性反应标准,在接受阿奇霉素治疗的20例患者中,并未出现Ⅲ、Ⅳ度的严重不良反应;有1例患者出现了一过性的肝功能异常,转氨酶轻度升高;2例患者出现用药后上腹部轻度不适。

两组患者均未见明显心悸、失眠、烦躁、体重增加、声嘶及口腔念珠菌感染。

讨论
支气管哮喘(bronchial asthma,BA)是一种常见的气道慢性炎症性疾病,这种慢性炎症是所有类型哮喘的共同特征,也是临床症状和气道高反应性的基础。

目前研究认为,哮喘的炎症反应主要是由于Th1/Th2平衡失调,抗原刺激使Th0向 Th1或Th2分化。

Th1主要合成释放IFN-γ、IL-2,促进细胞免疫,调节免疫抗感染的功能;Th2则主要生成IL-4、IL-5、IL-13等。

一般认为IFN-γ和IL-4、IL-5分别为Th1和T h2特征性细胞因子,IFN-γ可以促进Th0向Th1分化,促进嗜酸细胞的凋亡,用于哮喘病的治疗;IL-4则促进Th0向Th2分化,诱发哮喘症状加重。

然而,哮喘的炎症反应调控网络是非常复杂的,Th1/Th2平衡失调理论并不能完全解释哮喘的免疫失调机制,试图通过上调纠正的免疫偏倚来治疗哮喘的思路过于简单。

目前提出了一种基于Treg细胞理论的新卫生学假说,认为CD4+CD25+Treg细胞可同时抑制Th1或Th2介导的病理过程,在哮喘的发病过程中发挥着重要作用。

大量研究证实,T细胞尤其是Th2细胞,及其细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13在哮喘的气道炎症中发挥着关键作用[7-10]。

IL-4在炎症反应中的主要作用是促进Th0向Th2分化,诱发哮喘症状加重。

IL-5是CD4+T细胞源性细胞因子,可诱导活化B 细胞产生抗体,哮喘患者气道内IL-5 m RNA的表达水平明显高于健康志愿者,同时IL-5还是嗜酸性粒细胞成熟和分化的主要因子。

IL-13主要通过作用于气道上皮细
胞和平滑肌细胞,而不是传统的嗜酸性粒细胞和Ig E介导的途径,在过敏性反应中起到关键作用。

利用IL-13可溶性受体IL-13Rα 2与IL-13结合,可以抑制哮喘鼠模
型的哮喘症状出现。

同时,在IL-4、IL-5和气道炎症反应存在的情况下,缺失IL-13
的鼠模型不能产生气道高反应性[11]。

IL-13还参与诱发哮喘特征性的气道嗜酸性
粒细胞性炎症,使黏液产生增加和气道高反应性增加[12]。

IFN-γ是主要的Th1细
胞源性细胞因子,可抑制抗原诱导的气道内嗜酸性粒细胞浸润和高反应性,抑制Th2
细胞活性,其与肺功能的下降呈明显的正相关性。

另外,还有多种细胞因子参与哮喘
的炎症过程 ,如 IL-8、TNF-α、IL-9、IL-10 等 ,并且发挥了重要作用。

IL-8细胞来源广泛,包括多种免疫细胞或非免疫细胞,如单核巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒
细胞等,在刺激因子的作用下产生IL-8。

IL-8是中性粒细胞和T淋巴细胞的重要趋
化因子,能够激活中性粒细胞,诱导嗜碱性粒细胞释放组织胺和白三烯等,趋化嗜酸性粒细胞在气道黏膜内的聚集等。

前炎症因子TNF-α可通过内皮细胞表面的黏附分
子表达上调招募淋巴细胞、诱导细胞因子和炎症因子合成增加。

哮喘患者肺泡灌洗液、肺组织中TNF-α含量增加。

吸入TNF-α可以引起健康志愿者气道反应性增高,并诱导痰中中性粒细胞计数增加,而TNF-α抗体可以减轻气道高反应性和哮喘症状[13]。

IL-10则可以促进 Th0细胞向具有调节功能的Treg细胞分化,最具代表性的是CD4+CD25+产生大量IL-10的 TR亚群,可同时抑制 Th1或Th2介导的病理过程。

在本研究中,我们发现实验组(A、B组)治疗前后,诱导痰细胞因子浓度(IL-4 、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ)均有明显下降 ,但在治疗 12周后两组细胞因子浓度仍显著高于健康对照组。

两组IFN-γ水平在治疗后均较治疗前有显著下降,
但IFN-γ/IL-4却明显升高,与治疗前相比,差异有统计学意义。

组间分析发现,A、B
组治疗前,诱导痰细胞因子浓度(IL-4 、IL-5 、IL-8、IL-10 、IL-13、TNF-α、IFN-γ)无统计学差异;治疗12周后,A组细胞因子 IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IFN-γ的
浓度较 B 组更低,且治疗后A组的IFN-γ/IL-4浓度比值明显高于B组,提示联合阿奇霉素可以更有效地减轻气道内的炎症反应程度,调节Th1/Th2平衡。

而IL-10和TNF-α的浓度在治疗后两组间未显示出统计学差异,可能是由于本实验随访时间偏短或药物剂量偏小所致,有待进一步研究探讨。

另外,在治疗过程中,患者并未出现严重的不良反应。

综上所述,以ICS加LABA为基础的哮喘治疗方案可以安全、有效地降低气道内细胞因子的浓度,减轻气道炎症反应程度,而联合小剂量阿奇霉素能够增加ICS的抗炎活性,发挥协同作用,更加有效地控制气道炎症,降低哮喘患者Th2气道炎症因子浓度,调节Th1/Th2平衡,为治疗哮喘提供了选择方案。

参考文献
[1]Amsden GW.Anti-inflammatory effects of macrolides—an underappreciated benefit in the treatment of community-acquired respiratory tract infections and chronic inflammatory pulmonary conditions?[J].J Antimicrob Chemother,2005,55(1):10-21.
[2]Sharma S,Jaffe A,Dixon G.Immunomodulatory effects of macrolide antibioticsin respiratory disease:therapeutic implications for asthma and cystic fibrosis[J].Paediatr Drugs,2007,9(2):107-118.
[3]Williams AC,Galley HF,Watt AM,et al.Differential effects of three antibiotics on T helper cell cytokine expression[J].Journal o f Antimicrobial Chemotherapy,2005,56(3):502-506.
[4]Simpson JL, Pow ell H, Boyle MJ, et al.Clarithromycin targets neutrophilic airway inflammation in refractory asthma[J].Am J Respir Crit Care
Med,2008,177(2):148-155.
[5]Johnston S L,Blasi F,Black PN,et al.The effect of telithromycin in acute
exacerbations of asthma[J].N Eng l J Med,2006,354(15):1589-1600.
[6]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2008,31(3):177-189.
[7]Kostadima E,Tsiodras S,Alexopoulos EI,et al.Clarithromycin reduces the severity of bronchial hyperresponsiveness in patients with asthma[J].Eur Respir J,2004,23(5):714-717.
[8]Kozyskyj AL,Ernst P,Becker AB.Increased risk of childhood asthma from antibiotic use in early life[J].Chest,2007,131(6):1753-1759.
[9]Kiss A,Montes M,Susarla S,et al.A new mechanism regulating the initiation of allergic airway inflammation[J].J Allergy Clin
Immunol,2007,120(2):334-342.
[10]Ge XN,Bahaie NS,Kang BN,et al.Allergen-induced airway remodeling is impaired in galectin-3-deficient mice[J].J Immunol,2010,185(2):1205-1214.
[11]Botterma RW,Nolte IM,How ard TD,et al.Interleukin 13 and interleukin 4 receptor-alpha polymorphisms in rhinitis and asthma[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,153(3):259-267.
[12]Nafe LA,Declue AE,Lee-Fow ler TM,et al.Evaluation of biomarkers in bronchoalveolar lavage fluid for discrimination between asthma and chronic bronchitis in cats[J].Am J Vet Res,2010,71(5):583-591.
[13]Kim SH,Kim DH,Lavender P,et al.Repression of TNF-alpha-induced IL-8 expression by the glucocorticoid receptor-beta involvesinhibition of histone H4 acetylation[J].E xp Mol Med,2009,41(5):297-306.。