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8-MOP+UVA联合处理组P53, P21WAF-1 及 P16INK-4a蛋白 表达水平明显高于对照组（P值均<0.01），而UVA辐射组相 关蛋白水平也有明显增高（P值均<0.05），8-MOP+UVA联合 处理组及UVA照射组两组间经t检验比较，前者相应蛋白表达水 平均高于后者（P值均<0.05）。
8-oxo-d G阳性核比例（%）
120 100
80 60 40 20
0 对照组
8-MOP组
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UVA组
8-MOP/UVA组
**
*
3. Real-Time PCR检测各组细胞端粒相对长度比较
端粒相对长度
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
对照组
8-MOP组
* **
UVA组
8-MOP/UVA组
1.5
1.0
#
###
0.5
0.0
对照 黄芩苷
UVA UVA+黄芩苷
c-myc
p53
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p16蛋白表达水 平 c-myc蛋白表达水 平
对照 黄芩苷
UVA UVA+黄芩苷
4. 黄芩苷对UVA辐射后细胞p16和c-myc蛋白水平的影响
8
6
4
2
0
对照
黄芩苷
# ##
UVA
UVA+黄芩苷
1.5
1.0
8-MOP+UVA联合处理组端粒相对长度明显短于对照组（2.57±0.05 vs 6.63±0.12，P<0.01）UVA照射组（4.59±0.07 vs 6.63±0.12, ） 8-MOP+UVA联合处理组（2.57±0.05 vs 4.59±0.07）端粒相对长度 经t检验比较均短于对照组（P<0.05） ，后者端粒长度更短。而8-MOP
➢光老化：在内源性老化的基础 上加之环境因素（主要为紫外 线辐射）的损害而发生的外源 性老化，临床上表现为提前出 现更加严重的老化表现。
端粒与光老化
PH
1.研究背景
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光老化皮肤的动物模型观察光损伤作用
空白组
UVA
8-MOP+UVA
8-MOP+UVA
照光三个月 的小鼠皮肤
空白组1
骆丹电子版copy UVA组
关（r值依次为0.968, 0.943）。
3. GS-Rg1显著减缓端粒缩短
端粒相对长度（T/S）
8
7
各组细胞于照光后第7日端粒长度比较
6 5
**
4
*
3
2
1
0
对照组 8-MOP/UVA组
Rg1-5
Rg1-10
Rg1-20
GS-Rg1各浓度干预组端粒相对长度（2.57±0.05） 明显长于8-MOP+UVA联合处理组（6.63±0.12，P<0.01）， 且各浓度组之间端粒相对长度与GS-Rg1浓度有明显的正相关， 表现出一定的剂量依赖性（P<0.05）；高剂量组GS-Rg1干预组
端粒长度接近对照组水平，两骆者丹无电子明版c显opy统计学差异（P>0.05）
4. GS-Rg1显著降低老化相关蛋白的表达水平
GS-Rg1各浓度干预组老化相关蛋白 P53, P21WAF-1 及 P16INK-4a的表达 水平明显低于8-MOP+UVA组 （P值均<0.01），且各浓度组之间 蛋白表达水平与GS-Rg1药物浓度有 明显的负相关
免疫荧光检测 细胞内氧化 光产物
8-oxo-dG
Real-Time PCR检测端 粒的相对长 度：T/S
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Western Blot 检测细胞老化 相关蛋白P53, P21WAF-1及
P16INK-4a
1.各组细胞照光处理后各时间段细胞半乳糖苷酶阳性率
照光后24h、48h、72h及7d后8-MOP+UVA联合处理组SA-β-Gal 阳性细胞比例较对照组均明显增高（*P<0.01）， 且随时间积累而逐渐增高（r=0.988)。
处理组（6.62±0.09）与对照组之间无统计学差异（P>0.05） 骆丹电子版copy
4. WB 检测各组细胞老化相关蛋白表达水平
蛋白相对表达水平（灰度值）
4 各组老化相关蛋白表达水平比较
3.5
3
2.5
P53
2
P21WAF-1
1.5
P16INK-4a
1
0.5
0 对照组
8-MOP组
UVA组
8-MOP/UVA组
8-MOP+UVA组
照光7d后各组细胞超微结构
8000×
对照组
15000 ×
8000×
8-MOP组
15000 ×
8-MOP+UVA组细胞出现了明显的细胞衰老改变:胞浆中可见较多空泡，细胞核中可见较多 絮状物,核仁不清晰，局部出现核膜内褶,核内染色质凝集且分布不均。线粒体肿胀、粗面内
质网扩张,脱颗粒，可见较多次级溶酶体。
照光后时间
1 空白组
0.9
IPL照射后孵育1h
0.8 0.7
IPL照射后孵育12h IPL照射后孵育24h IPL照射后孵育48h
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Ⅰ型前胶原
Ⅲ型前胶原
强脉冲光改善真皮I型和III型胶原的数量与排列
曹妍，骆丹，陈斌/强脉冲光对BALB/c小鼠皮肤胶原骆的丹影电响子。版co中py华皮肤科杂志；2007, 40 ：748-51。
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研究内容——实验流程
对照组
8-MOP组 or
UVA组
8-MOP+UVA
药物组
MTT法检测 细胞活性绘制 细胞生长抑制 曲线
流式细胞术 检测细胞 周期分布
处理后24h，48h, 72h, 7d
透射电镜 观察细胞 超微结构
细胞化学酶 法检测β-半乳 糖苷酶
分光光度法
检测细胞内
氧化应激损伤 水平 ：MDA, SOD及T-AOC
8000×
UVA组 15000 ×
8000× 8-MOP+UVA组 15000 ×
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➢端粒结构特点--光损伤易感性： 2.端粒与光老化
光老化中紫外线引起的基因的氧化应激损伤，大部分情 况下发生在鸟嘌呤残基；端粒的重复序列TTAGGG二 分之一是鸟嘌呤残基且3’末端也富含鸟嘌呤。
-TTAGGG-结构
(r1=0.981，r2=0.916，r3=0.914)。 β-Actin
P53
P21WAF-1
照光后第7日老化相关蛋白表达水平
P16INK-4a 骆丹电子版copy
讨论
➢ GS-Rg1预处理的人真皮成纤维细胞显示出较强的氧化应激耐
受性，细胞内基因氧化产物8-oxo-dG产生明显减少；
➢ GS-Rg1预处理的细胞端粒结构中相应碱基损伤较光老化模型 组明显减弱，端粒结构稳定性加强，端粒缩短减缓；
#
0.5
#
##
0.0
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结论
人参皂苷-Rg1可有效缓解细胞内氧化应激损伤，减少基
因中光产物形成，减轻端粒损伤从而抑制端粒缩短，阻止 端粒临界长度激活P53老化检查点，阻止细胞周期受抑的信 号转导，降低老化相关蛋白表达水平，从而发挥显著的抗 光老化作用 黄芩苷可有效保护人成纤维细胞免于氧化损伤和延缓光老 化进程。其抗光老化机制包括延缓端粒缩短、调节老化相 关基因包括p66、p53、p16、c-myc、MMP-1和TIMP-1表 达有关，但黄芩苷对细胞端粒酶活性没有影响。
IPL 对小鼠皮肤Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA 表达影响的时效图
对照组
强脉冲光 处理8w后（I and III）
干 预 前
干 预 后
两型前胶原/GAPDH mRNA 比值
光密度值
1
0.8
I型前胶原
III型前胶原
0.6
0.4
0.2
0 空白 1d 3ds 1wk 2wks 3wks 4wks 6wks 8wks
➢ GS-Rg1预处理的细胞由于端粒缩短减缓，其对老化检查点的 激活受抑制，老化相关蛋白表达水平明显降低；
➢ 综上所述：GS-Rg1预处理可阻止基因损伤后对细胞老化P53 检查点的激活，抑制其后细胞周期激酶抑制剂P21WAF-1 及 P16INK-4a的表达，减弱两者对细胞周期激酶CDK的抑制作用， 使得CDK得以和核因子Rb蛋白结合，Rb蛋白磷酸后促进细胞 生长周期相关基因进行转骆录丹电，子版使co得py 细胞恢复分裂活性。
3
2
1
0
对照
黄芩苷
## #
UVA
UVA+黄芩苷
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3. 黄芩苷对UVA辐射后细胞p53、p16 和c-myc mRNA水平的影响
对照 黄芩苷
UVA UVA+黄芩苷
4
#
3
##
2
1
0
p53
p16
2.5
#
2.0
##
1.5
1.0
0.5
0.0
对照 黄芩苷
UVA UVA+黄芩苷
p16
c-myc
###
8-MOP/UVA +IPL
Luo D, Cao Y, Wu D, Xu Y, Chen B, Xue Z/ Impact of intense pulse light irradiation on BALB/c mouse skin-in vivo
study on collagens, matrix metalloproteinas骆es丹a电nd子v版acscoupylar endothelial growth factor. Lasers Med Sci; 2007 Dec 15.
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➢NB-UVB和PUVA：临床上光疗法（治银屑病、白癜风）
的主要副作用之一是皮肤易出现光老化外观
➢光老化模型： 已联合利用8-MOP+ UVA建立小鼠皮肤光
老化模型， 在此基础上利用人皮肤成纤维细胞经相同处理建 立体外光老化模型
内源性老化中的端粒缩短机制 1.是否参与紫外线辐射引起的光老化？ 2.光老化进程中光损伤是如何加快端粒缩短的？
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光疗临床改善光老化——
“Traditonal 激光磨削 ”(临床图片) 点阵激光（临床图片） 强脉冲激光 治疗光老化及保健嫩肤（临床图片）
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IPL对小鼠光老化皮肤的改善作用
空白组1
UVA组
8-MOP/UVA组
空白组1
UVA组
8-MOP/UVA组
空白2
UVA+IPL组
SA-β-Gal
对照组
8-MOP组
UVA组 8-MOP+UVA组 Nhomakorabea电镜
结论： 8-MOP+UVA联合作用可使皮肤FB出现光老化生物学特性改变
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2. 照光后2h各组细胞光产物8-oxo-dG8-羟基脱氧鸟嘌呤
对照组
UVA组
8-MOP+UVA组8-oxo-dG阳性 细胞核比例明显高于对照组 （**P<0.01 ）；UVA组8oxo-dG阳性细胞核比例也明显 高于对照组（*P<0.05 ）； 而8-MOP处理组较对照组无明 显统计学差异（P>0.05 ）
➢ 综上所述： 8-MOP+UVA联合作用可导致基因的氧化应激损 伤，端粒受损严重，缩短加速，并激活老化相关蛋白表达。
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3. 药物-端粒-光老化
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阳性细胞比例（%）
1. GS-Rg1有效降低老化特征酶β-半乳糖苷酶表达
120 100
80 60 40 20
0
SA-β-Gal染色结果 8-oxo-dG免疫荧光结果
Pay attention to UVR (SPF -PA) ,please
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对照组 8-MOP/UVA组 Rg1-5组
Rg1-10组
Rg1-20组
* **
各组细胞照光后相应时间点SA-β-Gal 及8-oxo-dG表达水平
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GS-Rg1各浓度干预组基因氧 化产物8-oxo-dG及SA-β-Gal阳 性率均明显低于光老化模型组 （P<0.05）且与药物剂量负相
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讨论
➢ 在UVA照射下，外源性光敏剂8-MOP使细胞的基因氧化应激损 伤显著加重，产生大量氧化光产物8-oxo-dG ；oxodeoxyguanosine
➢ 8-MOP+UVA联合作用后，细胞端粒结构上由于较多氧化光产 物的产生，使其端粒缩加速，提前到达临界长度；
➢ 8-MOP+UVA联合作用后由于端粒缩短加速，提前激活P53老 化检查点，并依次激活下游信号蛋白-细胞周期激酶抑制剂 P21WAF-1 及 P16INK-4a蛋白，相应蛋白表达水平明显增高；
黄芩苷对端粒缩短及光老化的影响
1、黄芩苷对UVA辐射后β-半乳糖苷酶阳性细胞比率的影响
β-半乳糖苷酶阳性细胞比率
β-半乳糖苷酶阳性细胞比率变化
80 70 60 50 40 30 20 10
0 对照
黄芩苷
UVA
UVA+黄芩苷
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2. 黄芩苷对UVA辐射后细胞端粒长度的影响
端粒长 度
4