卵巢癌患者外周血Treg细胞检测及临床意义

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０５．０７·临床实验研究·
卵巢癌患者外周血Ｔｒｅｇ细胞检测及临床意义
李晗，赵枰，曹兴建，陈相（南通市第一人民医院检验科，江苏南通２２６００１）
摘要：目的　探讨卵巢癌患者外周血淋巴细胞亚群及ＣＤ４＋ＣＤ２５＋调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）表达水平的变化及其临床意义。

方法　采用流式细胞术检测４８例卵巢癌患者外周血标本中Ｔｒｅｇ细胞占ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的比率及淋巴细胞亚群分布，分析Ｔｒｅｇ细胞与卵巢癌患者临床病理参数之间的关系。

结果　与健康人对照组相比，卵巢癌患者外周血标本中ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞及ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比值均升高（Ｐ均＜０．０１），且Ｔｒｅｇ细胞占ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的比率明显升高（Ｐ＜０．０１），而ＣＤ１６＋
ＣＤ５６＋ＮＫ细胞的表达水平显著降低（Ｐ＜０．０１）；卵巢癌患者外周血标本中Ｔｒｅｇ细胞占ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的比率与患者年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移及是否合并ＣＡ１２５升高均无关（Ｐ＞０．０５），而与ＦＩＧＯ分期、分化程度及是否存在腹水密切相关
（Ｐ＜０．０５）。

结论　检测外周血Ｔｒｅｇ细胞可用于评估卵巢癌患者的病情进展。

关键词：淋巴细胞亚群；Ｔｒｅｇ细胞；卵巢癌
中图分类号：Ｒ４４６ 文献标志码：Ａ
免疫功能低下可能是肿瘤发生关键的内因，而机体的细胞免疫功能状态发挥了重要作用。

ＣＤ４＋
ＣＤ２５＋调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）是近年来研究较多的具有免疫抑制功能的Ｔ细胞亚群，能
抑制Ｔ细胞对自身抗原的免疫应答，在肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要的作用［１ ２］。

多项研究显示，在包括卵巢上皮性癌在内的多种肿瘤患者外周血和肿瘤组织中Ｔｒｅｇ细胞的比例显著升高［３ ４］。

本研究通过检测卵巢癌患者外周血标本中免疫细胞亚群与
Ｔｒｅｇ细胞的变化，并结合患者的临床病理参数进行分析，以期探讨其临床应用价值。

１　资料与方法
１．１　一般资料　选取２０１７年６月至２０１９年３月于南通市第一人民医院妇产科门诊就诊的卵巢癌初治
患者４８例，年龄４７～７２岁，中位年龄５６岁。

纳入标准：（１）所有病例均经本院２位高年资病理医师依据２１０４年ＷＨＯ卵巢癌组织学分类标准诊断为乳腺癌；（２）所有病例均无感染、血液病、免疫系统疾病、妇科其他疾病及其他系统恶性肿瘤；（３）既往无卵巢相关手术史及半年内未接受过其他手术治疗；（４）均可查阅到完整的临床资料。

其中浆液性腺癌２９例、黏液性腺癌１６例、其他上皮性卵巢癌３例；ＦＩＧＯ临床分期：Ⅰ～Ⅱ期１７例，Ⅲ～Ⅳ期３１例；分化程度：低分化２９例，中分化１１例，高分化８例。

选取同期就诊的体检健康者３０例作为健康人对照组，年龄４４～７０岁，中位年龄５６岁。

两组间年龄差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

１．２　仪器与试剂　ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ１６＋ＣＤ５６ ＰＥ／ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ／ＣＤ１９ ＡＰＣ、ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ８ ＰＥ／ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ／ＣＤ４ ＡＰＣ（北京同生时代生物公司）；ＣＤ４
ＦＩＴＣ、ＣＤ２５ ＰＥ、ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１ ＰＥ及ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪（美国ＢＤ公司）；电化学发光全自动免
疫分析系统Ｃｏｂａｓｅ６０１及其ＣＡ１２５配套试剂（瑞士
Ｒｏｃｈｅ公司）；Ｆｉｃｏｌｌ淋巴细胞分离液（天津灏洋华科生物科技公司）。

１．３　方法
１．３．１　标本采集　所有患者于手术前采集空腹静脉血５ｍＬ，其中２ｍＬ经ＥＤＴＡ Ｋ２抗凝，混匀，１ｈ
内进行淋巴细胞亚群检测；其余３ｍＬ经３０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，收集血清标本，２ｈ内送检。

１．３．２　淋巴细胞亚群检测　取２个流式管，分别加入５０μＬ全血标本，再加入２０μＬ相应荧光素标记
抗体试剂（ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ１６＋ＣＤ５６ ＰＥ／ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ／ＣＤ１９ ＡＰ和ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ８ ＰＥ／ＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ／ＣＤ４ ＡＰＣ），涡旋混匀３ｓ，室温避光反应
１５ｍｉｎ，加入１ｍＬ溶血剂，涡旋混匀１０ｓ，室温避光温育１０ｍｉｎ，加入４ｍＬ细胞染色缓冲液洗涤，
５００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃去上清液（剩余２００μＬ），涡旋混匀３ｓ，重复洗涤１次，加入２００μＬ细胞染色缓冲
液重悬，上流式细胞仪检测，采用Ｍｕｌｔｉｓｅｔ软件获取数据并自动分析。

１．３．３　Ｔｒｅｇ细胞检测　采集患者术前外周血４ｍＬ，肝素抗凝，混匀备用。

按照Ｆｉｃｏｌｌ淋巴细胞分离液
基金项目：南通市卫生局青年基金资助项目（ＷＫＺＬ２０１８０２１）。

作者简介：李晗，１９７４年生，女，副主任技师，大学本科，主要从事临床检验工作。

通信作者：陈相，主任医师，Ｅ ｍａｉｌ：ｎｔｃｈｅｎｘ０５２０＠１６３．ｃｏｍ。

说明书提取单个核细胞，加入溶血剂２００μＬ以溶解红细胞，混匀１０ｓ，室温避光温育１０ｍｉｎ，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入４ｍＬＰＢＳ洗涤，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入２００μＬＰＢＳ，涡旋混匀３ｓ，取１００μＬ加至流式管底，分别加入ＣＤ４ ＦＩＴＣ、
ＣＤ２５ ＰＥ单克隆抗体（１∶５０稀释）各２０μＬ，同型对照ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１ ＰＥ（１∶１００稀释）各２０μＬ，涡旋
混匀３ｓ，室温避光反应２５～３０ｍｉｎ，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入４ｍＬ细胞染色缓冲液洗涤，
５００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液，加入４００μＬ细胞染色缓冲液重悬，上机检测。

１．３．４　血清ＣＡ１２５检测　取上述患者血清５００μＬ，按照电化学发光全自动免疫分析系统Ｃｏｂａｓｅ６０１
及其ＣＡ１２５配套试剂说明书检测血清ＣＡ１２５的表达水平。

ＣＡ１２５参考范围：０～３５Ｕ／ｍＬ。

１．４　统计学分析　采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行数据处理，采用Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ ＳｍｉｒｎｏｖＺ检验对数据进行
正态性和方差齐性分析，符合正态分布的数据以珋ｘ±ｓ表示，两组间比较用两独立样本的ｔ检验，３组间比较用方差分析，组间两两比较用ＳＮＫ ｑ检验。

以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果
２．１　各组淋巴细胞亚群及Ｔｒｅｇ细胞的表达　与健康人对照组相比，卵巢癌患者外周血Ｔｒｅｇ细胞占
ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的比率明显升高（Ｐ＜０．０１），且
ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞及ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比值均升高（Ｐ均＜０．０１），而ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ细胞表达水平显
著降低（Ｐ＜０．０１），见表１。

表１　卵巢癌患者外周血淋巴细胞亚群及Ｔｒｅｇ细胞水平（％，珋ｘ±ｓ）
组别健康人对照组卵巢癌组ｔＰ值ＣＤ３＋６６．１０±９．２８８０．１０±１１．８９ －５．４８８０．０００
ＣＤ４＋３２．７０±５．７１４８．９４±１１．７０ －８．１７８０．０００
ＣＤ８＋３３．２３±８．１４３２．５０±１１．５４０．３０４０．７６２
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋１．０４±０．２９１．７６±０．８３ －５．４４４０．０００
ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ２１．２７±１０．１８９．０８±４．８２ ６．１３９０．０００
ＣＤ１９＋１２．６３±４．４３１０．８１±１２．１８０．７８５０．４３５
Ｔｒｅｇ９．９２±３．０６１３．１０±５．１９ －３．４０００．００１ 注： ，与健康人对照组比较，Ｐ＜０．０５。

２．２　Ｔｒｅｇ细胞／ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞含量与卵巢癌患者临床病理参数的关系　卵巢癌患者外周血中Ｔｒｅｇ
细胞占ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的比率与患者年龄、组织类型、肿瘤大小、淋巴结转移与否及是否合并ＣＡ１２５升高均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而与患者ＦＩＧＯ分期、细胞分化及是否存在腹水差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表２。

表２　不同临床病理参数的卵巢癌患者外周血中Ｔｒｅｇ细胞／ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞含量（％，珋ｘ±ｓ）
参数ｎＴｒｅｇ细胞ｔ／ＦＰ值年龄（岁）－１．５３００．１３３　＜５５１９１１．７０±３．９１
　≥５５２９１４．０１±５．７５
ＣＡ１２５－１．０７２０．２８９　正常１１１１．６２±４．８７
　升高３７１３．５３±５．２６
肿瘤大小（ｃｍ３）－１．１６４０．２６０　＜１２０３４１２．４２±４．２３
　≥１２０１４１４．７４±６．９２
细胞分化５．６０１０．００７　高８９．６０±３．７６
　中１１１０．８１±３．０２
　低２９１４．９３±５．４２
组织类型１．０６００．３５５　浆液性２９１３．８０±５．５３
　黏液性１６１１．５８±４．６２
　其他３１４．４６±３．９７
ＦＩＧＯ分期－２．７５２０．００８　Ⅰ＋Ⅱ期１７１０．４７±３．３６
　Ⅲ＋Ⅳ期３１１４．５２±５．４９
淋巴结转移１．２９９０．２００　有３２１３．７８±５．５２
　无１６１１．７３±４．２８
腹水２．５８９０．０１３　有３５１４．２１±５．３１
　无１３１０．１０±３．４６
注： ，与高、中分化比较，Ｐ＜０．０５。

３　讨论
Ｔｒｅｇ细胞是Ｓａｋａｇｕｃｈｉ等［５］在１９９５年发现的，是Ｔ淋巴细胞群体中的一种特殊类型。

区别于
Ｔ
Ｈ
１、ＴＨ２以及其他具有免疫调节功能的Ｔ淋巴细胞群体，Ｔｒｅｇ细胞具有免疫调控、免疫自稳及免疫抑
制功能，并参与多种疾病的发生、发展过程［６］。

在介导肿瘤细胞免疫逃逸的过程中，Ｔｒｅｇ细胞在维持对自身成分（肿瘤抗原）耐受的同时，能够有效阻止机体对肿瘤细胞的免疫应答。

Ｔｒｅｇ细胞主要通过细胞接触依赖性机制、分泌抑制性细胞因子以及干扰细胞代谢影响效应细胞的功能等机制发挥免疫作用［７ １０］。

本研究发现，卵巢癌患者外周血ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋
ＮＫ细胞比率明显降低，提示患者免疫细胞中自然杀伤肿瘤细胞的功能低下；而ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞比率
较健康人对照组明显升高，这一结果与赵艳勋等［１１］研究结果存在较大的差异。

分析原因可能与赵艳勋
等［１１］在其实验中仅考虑Ｔ淋巴细胞亚群的比率有关，柯星等［１２］的研究结果亦证实卵巢癌患者外周血中Ｔｒｅｇ细胞占ＣＤ４＋的细胞比率明显升高，即ＣＤ４＋
Ｔ细胞中具有免疫抑制性的Ｔｒｅｇ细胞增多，可抑制其他细胞亚群的活化和功能发挥，参与自身免疫耐
受和肿瘤细胞免疫逃逸等过程。

本研究通过分析Ｔｒｅｇ细胞占ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞比率与卵巢癌患者临床病理参数的关系发现显示，
Ｔｒｅｇ细胞／ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞比率含量与卵巢癌患者的年龄、肿瘤大小、组织类型、淋巴结转移与否以及
是否合并血清ＣＡ１２５升高等无明显相关性，而和患者的肿瘤细胞分化程度、ＦＩＧＯ临床分期以及是否合并腹水密切相关，提示卵巢癌外周血Ｔｒｅｇ细胞与肿瘤进展相关，这与戴然等［２］的研究结果相一致。

Ｔｒｅｇ细胞与卵巢癌的病程进展相关，随着肿瘤细胞生长活跃，可诱导机体产生的Ｔｒｅｇ细胞比率升高，
机体发挥抗肿瘤的免疫效应细胞活性被抑制，免疫应答减弱，有利于肿瘤细胞的免疫逃逸。

然而，本研究并未分析Ｔｒｅｇ细胞在肿瘤进展过程中的具体作用机制，今后需要进一步研究证实。

综上所述，检测外周血淋巴细胞亚群有助于了解肿瘤患者的机体细胞免疫状况，监测外周血Ｔｒｅｇ细胞有利于评估卵巢癌患者的病情进展。

对Ｔｒｅｇ细胞的功能特征及调节机制的进一步研究可能为卵巢癌免疫治疗提供有效的治疗靶点。

４　参考文献
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（收稿日期：２０１９ １２ ０９）
（本文编辑：许晓蒙，王海燕）。