血红蛋白的凝胶过滤_OK

而大分子则排阻于颗粒之外。
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▪ 凝胶层析(Gel chromatography):
▪ 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、 筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可 以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外， 而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛 孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被 凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav （被分离化 合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。 Kav 值的大小与凝胶床的总体积（ Vt ）、外水体积（ Vo ）及分离物本身的洗脱体积（ Ve ）有关，即：
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凝胶层析应用
1.生物大分子的纯化
▪ 凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分 离的，由于它的这一分离特性，以及它 具有简单、方便、不改变样品生物学活 性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化 生物大分子的一种重要手段，尤其是对 于一些大小不同，但理化性质相似的分 子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤 无疑是一种合适的方法。
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5.蛋白质的复性
▪ 为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤 层析技术也可以用来进行蛋白的体外复 性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之 间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复 性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过 凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化 。
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▪ 为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯 度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预 先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白 质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分 子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过 了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白 质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚 集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白 质进行分离。
▪ Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
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▪ 在限定的层析条件下， Vt 和 Vo 都是恒定
值，而 Ve 值却是随着分离物分子量的变化
而变化的。分离物分子量大， Kav 值小；
反之，则 Kav 值增大。因此，在同一凝胶
柱上分离分子量不同的物质时，由于流动
相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩
常用的色谱分离方法
一. 按两相所处的状态分类 ▪ 气相色谱法:气固色谱法,气液色谱法 ▪ 液相色谱法:液固色谱法,液液色谱法
二 .按固定相的几何形式分类 ▪ 柱色谱法 ▪ 纸色谱法 ▪ 薄层色谱法
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凝胶过滤技术特点
▪ 凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于 惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件 比较温和，可在相当广的温度范围下进行， 不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质 的保持有独到之处。对于高分子物质有很好 的分离效果。
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4.溶液的浓缩
▪ 利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品 溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗 颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量 的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入 凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在 外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可 得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本 不改变溶液的离子强度和pH值。
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实验主要步骤
凝胶溶胀
制备血红蛋 白样品
装柱 平衡（20min）
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形成层析柱 还原层
上样和缓冲 液洗脱
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装柱注意事项
▪ 1.装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分 层的界面时，需要重新装柱。
▪ 2.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩 散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不 到分离目的。
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凝胶层析的应用
▪ ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等） 溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法 除去，这一操作称为脱盐。
▪ ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、 蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物 质的分离提纯。
▪ ⑶测定高分子物质的分子量
▪ ⑷高分子溶液的浓缩
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▪ 3.进行实验时，注意与目标物分子量相似的尽 量少。
▪ 4.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、 无气泡。
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操作步骤1
▪ 1.装柱:
▪ 检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽 接在层析柱的下端.
▪ 加入1/8柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲 液,搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层 析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于12cm, 接上上端的柱帽,将其连线插入三角瓶里 磷酸盐缓冲液中,平衡20分钟.
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▪ 凝胶过滤层析中,小分子物质能进入填料内 部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除 在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过 凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同 分子量筛分开了。
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血红蛋白的凝胶过滤
凝胶排阻层析 (gel exclusion chromatography) 分子筛层析 ( molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (gel filtration)
2021/8是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体 的网状结构.
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步骤3
▪ A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启恒 流泵至液面与胶面相齐。关泵。
▪ B.上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面 相齐。关泵。
▪ C.上0.5ml血红蛋白样，开泵，至液面与 胶面相齐，关泵。
▪ D.同B操作。
▪ E.上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与 磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并 用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化 钾。
散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中
物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，
其最终结果是分子量大的物质先从柱中流
出，分子量小的物质则后从柱中流出。流
出物用部分收集器分管等量或等时地收集
起来，检测后分段合并相同组分的各管流
出物，即等于把分子量不同的物质相互分
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影响凝胶过滤的因素
▪ 层析柱的选择 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱 分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不 均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm
▪ 加样量 加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提 纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。
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影响分离效果的因素
1.基质的颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav
值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性 小，则分离效果很差，或根本不能分开。
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▪ 交联葡聚糖(sephadex)
▪ 琼脂糖凝胶(sepharose)
▪ 聚丙烯酰胺凝胶(BIO-Gel P)
▪ 硅胶 (Silicon dioxide or Silica gel)
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分子筛凝胶是一种不带电的具有三
维空间的多孔网状结构的物质，每
个颗粒的细微结构及筛孔的直径均
匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，
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操作步骤2
▪ 2.上样前的准备
▪ 调节恒流泵的流速为6—10滴/分钟,并将 其进水口与层析柱的下端接线相接.
▪ 撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一
致的滤纸片一块,检查胶面是否平整,层析
柱是否均匀.然后将胶面上的缓冲液用排
气键放至与胶面相齐,关上恒流泵.切忌干 胶!
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▪ 3.脱盐及去除小分子杂质
▪ 利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分 子杂质是一种简便、有效、快速的 方法，它比一般用透析的方法脱盐 要快得多，而且一般不会造成样品 较大的稀释，生物分子不易变性。 一般常用的是Sephadex G-25，另外 还有Bio-Gel P-6 等排阻极限较小的 凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成 品出售，使用方便，但价格较贵。
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2.分子量测定
在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve 与其分子量的对数成线性关系。
▪ Kav＝－b lg MW＋c
▪ Ve＝－b’ lg MW＋c’
▪ 由此通过对已知分子量的标准物质进行 洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准 曲线，然后在相同的条件下测定未知物 的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分 子量。
▪ 凝胶柱的鉴定 凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡
▪ 洗脱速度 一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离
效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而 会降低分辨率，而且实验时间会大大延长
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本实验的原理
▪ 本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入 FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋 白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由 于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其 流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原 为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下 移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧 合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄 色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地 观察到凝胶过滤的分离效果。