【精品】第5章荧光光谱.PPT课件

伴随电子自旋的改变。（ ）
结束语
谢谢大家聆听！！！
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吸收光谱与荧光强度（激发的选择？）
➢ 吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下 跃迁产生的荧光越强
强度
吸收光谱
强度
荧光光谱
波长
波长
5.2 荧光探测
5.2.1 荧光探测装置
两点区别： 1. 在入射光的垂直方向探测 2. 探测器前还有一个单色器
吸收光谱 荧光光谱
F-4500荧光光度计光路图（日立）
增强型绿色荧光蛋白 509 nm
四甲基罗丹明 576 nm
染料 667 nm
染料cy3的吸收、发射光谱
最大激发波长 550 nm 最大发射波长 570 nm (黄绿光)
绿色荧光蛋白（GFP）
➢ GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用 的活体报告蛋白
5.2.3 荧光探测方法
➢ 同步荧光光谱技术
常用有机荧光试剂

待测离子 Al3+，Fe-
B4O22Sn4+ Li+
荧光试剂 茜素紫酱R
苯偶姻 黄烷醇 8-羟基喹啉
吸收波长 470 nm 370 nm 400 nm 370 nm
荧光发射波长 500 nm 450 nm 470 nm 580 nm
5.3.2 有机物分析
➢ 脂肪族有机化合物
具有高度共轭体系的或脂环化合物能发射荧光，维生素A、萝卜素 结构简单的脂肪族化合物本身能发射荧光的不多，需与有机试剂形成 荧光化合物，可参考讲义中“荧光分析法测定丙三醇”的例子
5.1.4 影响荧光光谱的因素（外部）
➢ 入射光强，荧光强度与入射光强成正比 ➢ 溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响
特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用 增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加 ➢ 温度，升高温度 → 物质粒子碰撞增多 → 减弱荧光 ➢ pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大 ➢ 内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光 ➢ 自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收
5.1.3 产生荧光的基本条件
➢ 入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发 态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态振 动能级 ➢ 物质粒子要具有高的荧光效率
nF kF
nA kF ki
i
荧光过程速率常数， 由物质粒子本身决定
物质分子结构与荧光效率
➢ 具有大共轭双键的分子容易发射荧光，π→π*跃迁的 量子效率高，寿命短（10-9~10-7 s） ➢ 共轭效应越大，荧光效率越高，苯 < 萘 < 蒽
➢ 芳香族化合物
具有共轭不饱和体系结构，易于吸光，其中分子庞大而结构复杂的化 合物在紫外光辐射下能产生荧光
荧光较弱的芳香族化合物可与有机试剂反应获得荧光较强的物质
➢ 蛋白质：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）
荧光强弱：Trp >Tyr >Phe 激发和发射波长：Trp > Tyr > Phe 色氨酸和酪氨酸的荧光最大发射波长分别为348和302 nm 荧光峰存在重叠，可利用同步荧光光谱分离，Δλ<15 nm的同步荧光光 谱为酪氨酸的特征，Δλ>60 nm的同步荧光光谱为色氨酸的特征
器中充入氧气，测得吸光度为0.1，试问容器中单位体积内有多少个氧气分子？
2．下列化合物中，可产生荧光的化合物是( )
A
B
C NN
D
NN
3．荧光分光光度计中光源与检测器呈
角度，这是因为
。
4．荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。
（）
5．发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移
(1) 在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光 强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图
(2) 两种同步扫描形式——固定波长和固定能量 (3) 固定波长：激发波长与发射波长间隔固定 (4) 固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定 (5) 特点：① 与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善
5.3.3 定量分析
➢ 定量分析基础
} 荧光与吸收光强：IF IA
朗伯-比尔定律： IAI010bc
IF I010bc
IF2.30I30bc
稀溶液近似
➢ 分析方法可借用紫外-可见光谱法中的直接比较法、标准曲 线法、差示法等
课堂练习
1．氧气在760 nm附近的吸收截面约为10-27 cm2，假设在一个光程为1 m的气体容
5.2.2 荧光团
➢ 许多物质不会发射荧光或荧光效率低 ➢ 需要利用强荧光发射的荧光团（或荧光探针分子） ➢ 荧光探针分子需满足两个条件：
(1) 能与待测物质某个微区专一而牢固的结合 (2) 这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象
一些典型的荧光团
色氨酸 348 nm 4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚 461 nm
➢ 相位分辨荧光光谱技术
(1) 也可以用于测量荧光寿命 (2) 基本原理：用正弦（或余弦）方式调制激发光光强，这样发射光强 也会被正弦（或余弦）调制，由于吸收和发射之间的时间延迟，所以发 射光的调制信号相比于激发光存在相位延迟，测量该相位延迟就可以得 到荧光寿命 (3) 相分辨荧光技术是一种稳态测量技术，相比于时间分辨荧光技术， 其灵敏度更高。
② 能够增强强带而减小弱带的干扰 ③它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低， 但同时会把拉曼吸收峰拉宽 (6) 波长间隔的选择非常重要！
利用同步荧光光谱分离色氨酸1、酪氨酸2和苯丙氨酸3的重叠荧光峰
一般荧光光谱
同步荧光光谱
(波长差70nm)
➢ 时间分辨荧光光谱技术
(1) 时间分辨荧光技术用于测量荧光发光过程（很短的衰减过程） (2) 用短脉冲信号激发荧光，取样积分探测随时间变化的荧光强度 (3) 时间分辨荧光技术可以对发射光谱重叠但寿命有差异的组分进行 测定，也可以测量荧光衰减曲线及寿命
苯
萘
蒽
物质分子结构与荧光效率（Cont.）
➢ 刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而 减小与其它分子碰撞的可能，芴 ≈1.0 > 联苯 0.18
芴
联苯
➢ 取代基也会影响荧光效率
给电子基(-NH2, OH)会增强荧光效率（共轭作用） 吸电子基(-NO2, -C=O, -C=NH)会减弱甚至猝灭荧光 取代基的空间阻碍作用会减弱荧光
5.3 荧光光谱法的应用
5.3.1 元素分析（无机离子）
➢ 能发射荧光的无机离子很少，一般不能直接测量 ➢ 无机离子的荧光分析法：直接法、荧光猝灭法、催化荧光法 ➢ 直接法：无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物，直接
测量络合物发射的荧光强度，很多元素可用该法，过渡金属离子除外
➢ 荧光猝灭法：无机离子本身不能形成荧光络合物，但可从金属-
有机荧光试剂络合物中夺取金属或有机试剂，形成更稳定的络合物，使 金属-有机荧光试剂络合物的荧光强度降低 ，比如：S, Fe, Co, Ag, Ni
➢ 催化荧光法：某些无机离子形成荧光络合物的速度很慢或荧光微
弱而难于测定，但在微量金属离子催化下可使反应迅速进行，这时可由 给定时间内测定的荧光强度来测量该金属离子浓度
第5章荧光光谱.
5.1 基本原理
荧光属于光致发光 包括吸收和发射两个过程 荧光光谱属于发射光谱 光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等 我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化
合物分析
5.1.2 荧光光谱与吸收光谱
形状
波长
谱带数
荧光光谱与吸收光谱的比较
➢ 荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9） ➢ 荧光光谱选择性好，能吸收光的物质不一定能发射荧光， 一定波长下不同物质的荧光光谱不同 ➢ 荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光， 并且荧光对环境因素非常敏感