插入式超声对酵母细胞膜通透性影响的研究
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1 - 600W；2 - 500W；3 - 400W
图 2 不同功率、作用时间对蛋白质的影响
1 - 600W；2 - 500W；3 - 400W
图 3 不同功率、作用时间对 FDP 的影响 由图 1、2、3 可见：随着超声作用时间的增加，不同功率的 超声胞内核酸、蛋白质及 FDP 的渗出浓度逐渐提高，其中，由 表中 数 据 可 知 600W 超 声 的 作 用 最 明 显，500W 超 声 次 之， 400W 超声的效果最差。综合前三幅图，超声 的 作 用 时 间 在 135S 以内时，胞外核酸、蛋白质、FDP 渗出浓度的增幅不很明 显，在 225S 左右，核酸、蛋白质、FDP 的测定值增加较快。
2 结果与讨论
2. 1 插入式超声对细胞膜通透性的影响
超声发生器的主要参数有功率、频率、作用时间，脉冲超声 还有脉冲间隔时间。下面分别讨论这几个参数对细胞膜通透 性的影响。 2. 1. 1 不同功率的超声作用不同的时间
取 5g 干酵母接种于 50mL 发酵液中，在 37C 发酵 1h，摇床 转速为 120r / min。然后放置于冰水浴中，用插入式超声处理， 超声 的 作 用 参 数 为：频 率 20 ~ 25khz，功 率 分 别 为 600W， 500W，400W，超声的作用时间为每次 3S，间隔时间为 4S，作用 的总时间分别为 0，90S，135S，180S，225S，270S。将处理后的发 酵液继续发酵 2h，发酵温度为 37C ，摇床转速为 120r / min。发 酵完毕后，取 20mL 发酵液于 80C 的水浴中灭酶，剩余部分置 于冰箱中备测细胞染色率用。其中以超声作用时间为 0S 的瓶 为空白对照。每组试验平行三次，结果取三次平行的平均值。
Keywords：uItrasound；ceII membrane；permeabiIity
膜通透性是细胞膜的重要功能，细胞通过膜通透性摄取细 胞外物质，排出细胞内物质，维持其生理功能［1］。改变细胞膜 通透性的方法一般有三种：化学法，物理法和生物法。生物法 包括生物素缺陷型、油酸缺陷型等［2］。
超声波是一种能量形式，当强度超过一定值时，将会使媒 质的状态、组分、结构或功能发生变化［3］。低频超声波的空化 作用可以导致细胞的非热效应，使细胞膜短时间内局部破裂， 从而改变细胞膜 通 透 性，使 胞 内 物 质 释 放 或 胞 外 物 质 入 细 胞 内。超声改变细胞膜通透性已在发酵工程、基因转导方面、强 化药物作用等方面得到应用。
Abstract：Yeast ceII，which can produce Fructose-1，6-diphosphate（ FDP），was chosen as object. Inner-ceII nucIeic acid and protein penetrating membrane after the disposaI of uItrasound was measured by uItravioIet radiation spectrometer to determine the extent of effect on ceII membrane penetrate. CeIIs treated by uItrasound were dyed by MethyIene BIue SoIution and counted by haemacytometer to examine the viabiIity of the ceIIs. And the variety of membrane permeabiIity was determined by testing the variety of FDP content in the broth. The resuIts showed that，probe uItrasound had great effect on ceII permeabiIity and IivabiIity. The intermittent time of puIsed uItrasound has IittIe infIuence on the transport of nucIeic acid，protein and on ceII activity. But it had great effect on the permeabiIity of FDP.
本论文的一个创新点是，使用超声波提高细胞通透性的同 时，并不伤害细胞本身，这是超声波优于其它方法的关键。另 外，超声作为一种能量场加入发酵液中，不会增加发酵液的有 机污染，对后续分离有着十分重要的意义。
1 材料与方法
1. 1 主要仪器设备
752 紫外光栅分光光度计，恒温振荡器 THZ-C，微型漩涡
混合器 H-1，微量取液器、电动离心机 80-2，电热恒温水浴锅 HS-GIIB-6，超声波细胞粉碎机 JY922-II，数控超声波清洗器 KO50DB。
［ 收稿日期］2005 - 11 - 23 ［ 作者简介］姚咏嫦（1979 - ），女，广东广州人，毕业于华南理工大学制药工程系，学士学位。
2006 年 第 1 期 第 33 卷 总第 153 期
广东化工 www. gdchem. com
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10min，倾弃上清液，重复一次。经上述处理过的白色沉淀再加 浓盐酸 3. 0mL，充分混匀后，2000r / min 离心 10min，将离心上 清浓盐酸溶液收集于另一干净试管中，再重复一次，收集浓盐 酸溶液 3. 0mL 于同一干净试管中，共 6. 0mL 备用。吸取上述 洗涤浓盐酸溶液 0. 10mL，加蒸馏水 1. 0mL，加显色液 0. 5mL， 浓盐酸 3mL 后，充分混匀。同时制备空白管和标准管。80C 水浴 14min，冷却至室温后测吸收值。样品中 FDP 的含量，可 按下面的公式换算：
WFDP = ODA / ODB X MFDP X C WFDP 为被测样品中 FDP 含量（ !g / mL）；ODA 为被测样品 中光吸引值；ODB 标准管光吸收值；MFDP 为标准液中的 FDP 毫 克数（ mg）；C 为样品稀释的倍数。 1. 3. 2 核酸与蛋白质的测定 发酵液先 80C 水浴 5min 灭酶，取经处理的发酵液，3000r / min 离心 20min 后，取上清液 0. 2mL，稀释 200 倍，然后用 752 紫外光栅分光光度计分别在 260nm 和 280nm 测定核酸和蛋白 质［4］。 1. 3. 3 细胞染色率的测定 酵母活细胞新陈代谢旺盛，活力强，还原力也强。无毒的 染料进入细胞，即被还原退色。但死细胞及代谢作用缓慢的老 弱细胞无此还原力。次甲基蓝是无毒染料，且能被活细胞还原 成无色，故可用来判断细胞的死活［5］。 以一块载玻片在灯焰上烧干净并冷却至室温。用滴管吸 取 0. 1% 次甲基蓝并放一滴于载玻片中央。用接种环取 1 ~ 2 环发酵液与次甲基蓝混匀，加上盖玻片（ 勿使产生气泡），染色 3 ~ 5min。将制好的标本片用高位镜观察，根据是否染上颜色 来区别死活细胞。利用血球计数器在显微镜下直接数出死活 细胞的数目，酵母死亡率的计算方法为： 酵母死亡率（ % ）=（ 染色细胞总数 / 酵母细胞总数）X 100%
［ 关键词］超声；细胞膜；通透性
Effect of Probe Ultrasound on Yeast Cell Membrane Permeability
Yao Yongchang （ Guangdong PetrochemicaI Engineering Design Ins）
1. 2 实验材料
啤酒酵母，葡萄糖，Na2 HPO4 ，NaH2 PO4 ，MgCI2 ，NaCI，甲苯， 醋酸钡，间 苯 二 酚，硫 脲，冰 醋 酸，酚 酞，乙 醇，盐 酸，NaOH， FDP。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 FDP 含量的测定 发酵 液 先 经 80C 水 浴 5min 灭 酶，取 经 处 理 的 发 酵 液，
3000r / min 离心 20min 后，取上清液 0. 5mL，加 1. 0mL 蒸馏水混 匀，滴加 1 小滴含 w = 1% 的酚酞指示剂，混匀。用微量取液 器，取 0. 01moI NaOH 调至试管中溶液微红（ pH 约 8. 3）。此时 加入含 w = 25% 的乙酸钡溶液 0. 5mL，继续用 0. 01moI NaOH 调至沉淀物保持微红色，放置在室温下 15min 后，2000r / min 离 心 10min，倾弃上清液。于白色沉淀中加含 ! = 75% 的乙醇少 许，在 微 型 漩 涡 混 合 器 H-1 上 充 分 混 匀 后，2000r / min 离 心
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增加，所以本实验不采用大于 600W 的超声处理。 2. 1. 2 脉冲超声不同的间隙时间对细胞膜通透性的影响
取 5g 干酵母接种于 50mL 发酵液中，在 37C ，摇床转速为 120r / min 的条件下发酵 1h，然后放置于冰水浴中，用超声处 理。超声的作用参数为：频率 20 ~ 25khz，功率分别为 600W， 500W，400W，超 声 的 作 用 时 间 为 每 次 3S，作 用 的 总 时 间 为 270S，间隔时间分别为 0S，4S，6S，8S，10S，12S。将处理后的发酵 液在相同的条件下继续发酵 2h 后，取 20mL 发酵液于 80C 的 水浴中灭酶，剩余部分置于冰箱中备测细胞染色率用。其中以 没有经过超声处理的瓶为空白对照。每组试验平行 3 次，结果 取 3 次平行的平均值。
图 4 不同功率、作用时间对细胞存活率的影响 由 4 图可见，随着超声作用时间的增加，三种功率的超声 处 理 后，细 胞 的 存 活 率 都 逐 渐 减 小，即 细 胞 的 破 碎 程 度 增 大。 其中，600W 的超声使细胞存活率下降最快，500W 超声次之， 400W 超声最慢。但总的来说，超声处理后，细胞的存活率变 化不是很大，600W 超 声 作 用 270S 后 的 存 活 率 下 降 25. 1% 。 而且可以预见，随着超声功率的增加，超声对细胞的损伤也会
对灭酶后的发酵液分析，测出胞外的核酸、蛋白质、FDP 浓 度。如图 1、2、3 所示。
取未经灭酶的发酵液 0. 5mL，用 0. 9% 的生理盐水稀释 100 倍后，用次甲基蓝染色 5min，用血球计数板计数，算出细胞 的存活率，作图 4。
1 - 600W；2 - 500W；3 - 400W
图 1 不同功率、作用时间对核酸的影响
对灭酶后的发酵液分析，测出胞外的核酸、蛋白质、FDP 浓 度。如图 5、6、7 所示。
的三种不同功率的超声处理后，FDP 的渗出量均有很大程度的 提高，但当间隙时间增大到 6S，8S，10S 时，FDP 的渗出量反而下 降。而当间隙时间增加到 12S 时，FDP 的渗出量又有所上升。
图 8 不同间隙时间对细胞存活率的影响
从图 8 可以看出，经过超声处理后，酵母细胞的存活率都有所 下降，但随着超声间隙时间的增长，存活率的下降并没有表现出一 定的规律性，不同间隙时间的超声对存活率的影响相差也不大，也 就是说，脉冲超声的间隙时间对细胞活性影响不是很大。
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插入式超声对酵母细胞膜
通透性影响的研究
姚咏嫦
（ 广东石油化工设计院，广东 广州 510130）
［ 摘 要］本论文选择生产 1，6 - 二磷酸果糖（ FDP）的酵母细胞为研究对象，采用紫外分光光度计测定超声 处理后酵母细胞内核酸和蛋白质透出细胞膜的情况，使用次甲基蓝对超声处理后的细胞进行染色，用血球计数， 测试经超声处理后细胞的生存能力，及通过测定胞外 FDP 的浓度变化，反映细胞膜通透性的变化。结果表明， 插入式超声对细胞的通透性及细胞的存活率都有很大影响，而脉冲超声的间隙时间对核酸、蛋白质及细胞活性 影响不是很大，但对 FDP 的渗出率有较大影响。
图 2 不同功率、作用时间对蛋白质的影响
1 - 600W；2 - 500W；3 - 400W
图 3 不同功率、作用时间对 FDP 的影响 由图 1、2、3 可见：随着超声作用时间的增加，不同功率的 超声胞内核酸、蛋白质及 FDP 的渗出浓度逐渐提高，其中，由 表中 数 据 可 知 600W 超 声 的 作 用 最 明 显，500W 超 声 次 之， 400W 超声的效果最差。综合前三幅图，超声 的 作 用 时 间 在 135S 以内时，胞外核酸、蛋白质、FDP 渗出浓度的增幅不很明 显，在 225S 左右，核酸、蛋白质、FDP 的测定值增加较快。
2 结果与讨论
2. 1 插入式超声对细胞膜通透性的影响
超声发生器的主要参数有功率、频率、作用时间，脉冲超声 还有脉冲间隔时间。下面分别讨论这几个参数对细胞膜通透 性的影响。 2. 1. 1 不同功率的超声作用不同的时间
取 5g 干酵母接种于 50mL 发酵液中，在 37C 发酵 1h，摇床 转速为 120r / min。然后放置于冰水浴中，用插入式超声处理， 超声 的 作 用 参 数 为：频 率 20 ~ 25khz，功 率 分 别 为 600W， 500W，400W，超声的作用时间为每次 3S，间隔时间为 4S，作用 的总时间分别为 0，90S，135S，180S，225S，270S。将处理后的发 酵液继续发酵 2h，发酵温度为 37C ，摇床转速为 120r / min。发 酵完毕后，取 20mL 发酵液于 80C 的水浴中灭酶，剩余部分置 于冰箱中备测细胞染色率用。其中以超声作用时间为 0S 的瓶 为空白对照。每组试验平行三次，结果取三次平行的平均值。
Keywords：uItrasound；ceII membrane；permeabiIity
膜通透性是细胞膜的重要功能，细胞通过膜通透性摄取细 胞外物质，排出细胞内物质，维持其生理功能［1］。改变细胞膜 通透性的方法一般有三种：化学法，物理法和生物法。生物法 包括生物素缺陷型、油酸缺陷型等［2］。
超声波是一种能量形式，当强度超过一定值时，将会使媒 质的状态、组分、结构或功能发生变化［3］。低频超声波的空化 作用可以导致细胞的非热效应，使细胞膜短时间内局部破裂， 从而改变细胞膜 通 透 性，使 胞 内 物 质 释 放 或 胞 外 物 质 入 细 胞 内。超声改变细胞膜通透性已在发酵工程、基因转导方面、强 化药物作用等方面得到应用。
Abstract：Yeast ceII，which can produce Fructose-1，6-diphosphate（ FDP），was chosen as object. Inner-ceII nucIeic acid and protein penetrating membrane after the disposaI of uItrasound was measured by uItravioIet radiation spectrometer to determine the extent of effect on ceII membrane penetrate. CeIIs treated by uItrasound were dyed by MethyIene BIue SoIution and counted by haemacytometer to examine the viabiIity of the ceIIs. And the variety of membrane permeabiIity was determined by testing the variety of FDP content in the broth. The resuIts showed that，probe uItrasound had great effect on ceII permeabiIity and IivabiIity. The intermittent time of puIsed uItrasound has IittIe infIuence on the transport of nucIeic acid，protein and on ceII activity. But it had great effect on the permeabiIity of FDP.
本论文的一个创新点是，使用超声波提高细胞通透性的同 时，并不伤害细胞本身，这是超声波优于其它方法的关键。另 外，超声作为一种能量场加入发酵液中，不会增加发酵液的有 机污染，对后续分离有着十分重要的意义。
1 材料与方法
1. 1 主要仪器设备
752 紫外光栅分光光度计，恒温振荡器 THZ-C，微型漩涡
混合器 H-1，微量取液器、电动离心机 80-2，电热恒温水浴锅 HS-GIIB-6，超声波细胞粉碎机 JY922-II，数控超声波清洗器 KO50DB。
［ 收稿日期］2005 - 11 - 23 ［ 作者简介］姚咏嫦（1979 - ），女，广东广州人，毕业于华南理工大学制药工程系，学士学位。
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10min，倾弃上清液，重复一次。经上述处理过的白色沉淀再加 浓盐酸 3. 0mL，充分混匀后，2000r / min 离心 10min，将离心上 清浓盐酸溶液收集于另一干净试管中，再重复一次，收集浓盐 酸溶液 3. 0mL 于同一干净试管中，共 6. 0mL 备用。吸取上述 洗涤浓盐酸溶液 0. 10mL，加蒸馏水 1. 0mL，加显色液 0. 5mL， 浓盐酸 3mL 后，充分混匀。同时制备空白管和标准管。80C 水浴 14min，冷却至室温后测吸收值。样品中 FDP 的含量，可 按下面的公式换算：
WFDP = ODA / ODB X MFDP X C WFDP 为被测样品中 FDP 含量（ !g / mL）；ODA 为被测样品 中光吸引值；ODB 标准管光吸收值；MFDP 为标准液中的 FDP 毫 克数（ mg）；C 为样品稀释的倍数。 1. 3. 2 核酸与蛋白质的测定 发酵液先 80C 水浴 5min 灭酶，取经处理的发酵液，3000r / min 离心 20min 后，取上清液 0. 2mL，稀释 200 倍，然后用 752 紫外光栅分光光度计分别在 260nm 和 280nm 测定核酸和蛋白 质［4］。 1. 3. 3 细胞染色率的测定 酵母活细胞新陈代谢旺盛，活力强，还原力也强。无毒的 染料进入细胞，即被还原退色。但死细胞及代谢作用缓慢的老 弱细胞无此还原力。次甲基蓝是无毒染料，且能被活细胞还原 成无色，故可用来判断细胞的死活［5］。 以一块载玻片在灯焰上烧干净并冷却至室温。用滴管吸 取 0. 1% 次甲基蓝并放一滴于载玻片中央。用接种环取 1 ~ 2 环发酵液与次甲基蓝混匀，加上盖玻片（ 勿使产生气泡），染色 3 ~ 5min。将制好的标本片用高位镜观察，根据是否染上颜色 来区别死活细胞。利用血球计数器在显微镜下直接数出死活 细胞的数目，酵母死亡率的计算方法为： 酵母死亡率（ % ）=（ 染色细胞总数 / 酵母细胞总数）X 100%
［ 关键词］超声；细胞膜；通透性
Effect of Probe Ultrasound on Yeast Cell Membrane Permeability
Yao Yongchang （ Guangdong PetrochemicaI Engineering Design Ins）
1. 2 实验材料
啤酒酵母，葡萄糖，Na2 HPO4 ，NaH2 PO4 ，MgCI2 ，NaCI，甲苯， 醋酸钡，间 苯 二 酚，硫 脲，冰 醋 酸，酚 酞，乙 醇，盐 酸，NaOH， FDP。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 FDP 含量的测定 发酵 液 先 经 80C 水 浴 5min 灭 酶，取 经 处 理 的 发 酵 液，
3000r / min 离心 20min 后，取上清液 0. 5mL，加 1. 0mL 蒸馏水混 匀，滴加 1 小滴含 w = 1% 的酚酞指示剂，混匀。用微量取液 器，取 0. 01moI NaOH 调至试管中溶液微红（ pH 约 8. 3）。此时 加入含 w = 25% 的乙酸钡溶液 0. 5mL，继续用 0. 01moI NaOH 调至沉淀物保持微红色，放置在室温下 15min 后，2000r / min 离 心 10min，倾弃上清液。于白色沉淀中加含 ! = 75% 的乙醇少 许，在 微 型 漩 涡 混 合 器 H-1 上 充 分 混 匀 后，2000r / min 离 心
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增加，所以本实验不采用大于 600W 的超声处理。 2. 1. 2 脉冲超声不同的间隙时间对细胞膜通透性的影响
取 5g 干酵母接种于 50mL 发酵液中，在 37C ，摇床转速为 120r / min 的条件下发酵 1h，然后放置于冰水浴中，用超声处 理。超声的作用参数为：频率 20 ~ 25khz，功率分别为 600W， 500W，400W，超 声 的 作 用 时 间 为 每 次 3S，作 用 的 总 时 间 为 270S，间隔时间分别为 0S，4S，6S，8S，10S，12S。将处理后的发酵 液在相同的条件下继续发酵 2h 后，取 20mL 发酵液于 80C 的 水浴中灭酶，剩余部分置于冰箱中备测细胞染色率用。其中以 没有经过超声处理的瓶为空白对照。每组试验平行 3 次，结果 取 3 次平行的平均值。
图 4 不同功率、作用时间对细胞存活率的影响 由 4 图可见，随着超声作用时间的增加，三种功率的超声 处 理 后，细 胞 的 存 活 率 都 逐 渐 减 小，即 细 胞 的 破 碎 程 度 增 大。 其中，600W 的超声使细胞存活率下降最快，500W 超声次之， 400W 超声最慢。但总的来说，超声处理后，细胞的存活率变 化不是很大，600W 超 声 作 用 270S 后 的 存 活 率 下 降 25. 1% 。 而且可以预见，随着超声功率的增加，超声对细胞的损伤也会
对灭酶后的发酵液分析，测出胞外的核酸、蛋白质、FDP 浓 度。如图 1、2、3 所示。
取未经灭酶的发酵液 0. 5mL，用 0. 9% 的生理盐水稀释 100 倍后，用次甲基蓝染色 5min，用血球计数板计数，算出细胞 的存活率，作图 4。
1 - 600W；2 - 500W；3 - 400W
图 1 不同功率、作用时间对核酸的影响
对灭酶后的发酵液分析，测出胞外的核酸、蛋白质、FDP 浓 度。如图 5、6、7 所示。
的三种不同功率的超声处理后，FDP 的渗出量均有很大程度的 提高，但当间隙时间增大到 6S，8S，10S 时，FDP 的渗出量反而下 降。而当间隙时间增加到 12S 时，FDP 的渗出量又有所上升。
图 8 不同间隙时间对细胞存活率的影响
从图 8 可以看出，经过超声处理后，酵母细胞的存活率都有所 下降，但随着超声间隙时间的增长，存活率的下降并没有表现出一 定的规律性，不同间隙时间的超声对存活率的影响相差也不大，也 就是说，脉冲超声的间隙时间对细胞活性影响不是很大。
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插入式超声对酵母细胞膜
通透性影响的研究
姚咏嫦
（ 广东石油化工设计院，广东 广州 510130）
［ 摘 要］本论文选择生产 1，6 - 二磷酸果糖（ FDP）的酵母细胞为研究对象，采用紫外分光光度计测定超声 处理后酵母细胞内核酸和蛋白质透出细胞膜的情况，使用次甲基蓝对超声处理后的细胞进行染色，用血球计数， 测试经超声处理后细胞的生存能力，及通过测定胞外 FDP 的浓度变化，反映细胞膜通透性的变化。结果表明， 插入式超声对细胞的通透性及细胞的存活率都有很大影响，而脉冲超声的间隙时间对核酸、蛋白质及细胞活性 影响不是很大，但对 FDP 的渗出率有较大影响。