荧光定量PCR原理 扩增曲线55页PPT
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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件
灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
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荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
荧光定量PCR原理及应用(科研版)课件
01
绝对定量
数字PCR技术可以实现绝对定量 ，即直接测定目标分子的数目， 不受标准品和校准品的影响。
02
高灵敏度
数字PCR技术具有高灵敏度，能 够检测低拷贝数的基因或DNA片 段。
03
适用于稀有基因变 异检测
数字PCR技术适用于稀有基因变 异检测，如单基因遗传病和肿瘤 基因突变等。
基于微流控芯片的荧光定量PCR技术
通过荧光染料或探针，可以在PCR过程中实 时监测DNA的扩增情况，从而实现对起始 模板的定量分析。
特异性高
自动化程度高
通过特异性设计引物和探针，可以有效避 免非特异性扩增，提高检测的准确性。
荧光定量PCR可以实现全自动化，大大提高 了检测效率。
荧光定量PCR的局限性
需要特殊仪器
荧光定量PCR需要使用特定的荧光定量 PCR仪，限制了其应用范围。
A 成本较高
荧光定量PCR需要使用特殊的荧光 染料或探针，增加了实验成本。
B
C
D
需要标准化
由于不同仪器、不同实验条件下的荧光定 量PCR可能存在差异，因此需要进行标准 化处理，以确保结果的可靠性。
可能出现假阳性结果
由于荧光定量PCR的灵敏度极高，有时会 出现假阳性结果，需要注意实验质量控制 。
荧光定量PCR与其他方法的比较
荧光信号检测
在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测， 实时监测扩增产物量。
荧光定量PCR的荧光信号检测
荧光信号变化
随着PCR反应的进行，荧光信号 逐渐增强，通过荧光信号的变化 可以反映扩增产物量的变化。
定量分析
根据荧光信号的变化，可以对扩 增产物进行定量分析，从而确定 目标序列的拷贝数或浓度。
特异性分析
实时荧光定量PCR实验原理与技术 ppt课件
非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。
要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利
用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲 线分析。
熔解曲线峰为 单一峰形，未 见其他峰值， 并且峰的形状 也比较锐利。 扩增产物特异 性好。
qRT-PCR技术实验操作（优化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即
水解探针法
分子信标
Scorpion引物/探针 复合探针
qRT-PCR技术影响因素
① 样品RNA 的完整性 ② RNA 样品中的基因组 DNA污染
③ 特异性良好的引物
④ PCR反应体系的优化 ⑤ 反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的
mRNA的量 ⑥ 可靠的内标基因：
TEF-2
热循环参数的设置 上机前样本的制备 检测程序的设置 运行检测程序果分析 扩增曲线 结果的显示与输出
qRT-PCR技术实验操作
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
假阳性：荧光染料能和任何 ds DNA 结合，因此它也能与
qRT-PCR技术实验操作（优化）
1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大
2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差
总RNA提取； 2. 模板cDNA制作； 3. 半定量PT-PCR：
1.
1. 引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的
2.
3. 4. 5.
一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在 两个离得远的外显子上。 引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或 G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目 的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为 350bp-600bp之间 内参的选择 同管扩增或异管扩增的选择 PCR循环数的选择
荧光定量PCR基础原理ppt课件
荧光定量PCR基础原理
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探针完整时，汇报基团发射荧光信号被近距离淬灭基 团吸收；伴随PCR进行，Taq酶在链延伸过程中碰到与 模板结合探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针酶切降解 ，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，游离于反应 体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
荧光定量PCR基础原理
荧光定量PCR基础原理
11/39
普通PCR技术检测模式
普通PCR仪器扩增， 约2.5小时
琼脂糖凝胶电泳， 约1小时
阴性
无法定量
样品检测结果
阳性
EB染色，约20分钟 紫外成像
荧光定量PCR基础原理
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实时荧光定量PCR检测模式
荧光定量PCR仪器扩 增，约2小时
光滑S型指数曲线， 阳性
检测过程有实时监测 数据
Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能 量传递）原理设计。
荧光定量PCR基础原理
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TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物同时加入一个特异性荧光 探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在 两条引物之间。
TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标识，探针 5′端标识有荧光汇报基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
绝对定量
病原载量定量
GMO成份评定
残留DNA测定
相对定量
基因表示差异比较
治疗伎俩效果评定
荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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荧光定量PCR基础原理
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SYBR Green I荧光染料作用原理
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
荧光定量PCR原理扩增曲线ppt课件
遗传疾病的诊断
多重定量
24
内容概要
荧光定量PCR原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
25
绝对定量解析方法
26
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
?
Ct1 28.18
25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64
25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41
25.19 22.28 18.77 20.5
STD 0.16
0.04 0.12 0.10 0.05
31
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
30
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品
未知样品 空白对照
copies/ml 5×103
5×104 5×105 5×106
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
不能进行多重定量
18
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
多重定量
24
内容概要
荧光定量PCR原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
25
绝对定量解析方法
26
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
?
Ct1 28.18
25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64
25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41
25.19 22.28 18.77 20.5
STD 0.16
0.04 0.12 0.10 0.05
31
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
30
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品
未知样品 空白对照
copies/ml 5×103
5×104 5×105 5×106
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件
对引物特异性要求较高
不能进行多重定量
18
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
荧光定量PCR原理扩增曲线
设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品
未知样品 空白对照
copies/ml 5×103
5×104 5×105 5×106
不同定量方法的比较
方法 SYBR Green I
方法
TaqMan 方法
优点
缺点
适用范围
适用性广 灵敏 方便 便宜
引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量
适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重
组动植物的研究
特异性高 重复性好
价格高 只适合特定目标
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考核
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量相关产品
荧光检测元件
Baseline
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准 偏差的10倍
手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超过 域值
通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家 基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量。
目的基因定量结果
公式： 校正值= 管家基因定量结果
相对值=
待测样品的校正值 对照样品的校正值
相对定量分析——双标准曲线法
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
实验数据
Sample
标准品 标准品 标准品 标准品
未知样品 空白对照
copies/ml 5×103
5×104 5×105 5×106
不同定量方法的比较
方法 SYBR Green I
方法
TaqMan 方法
优点
缺点
适用范围
适用性广 灵敏 方便 便宜
引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重定量
适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重
组动植物的研究
特异性高 重复性好
价格高 只适合特定目标
病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考核
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量相关产品
荧光检测元件
Baseline
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是3～ 15个循环的荧光信号的标准 偏差的10倍
手动设置：大于荧光背景 值和阴性对照的荧光最高值； 进入指数期的最初阶段
真正的信号:荧光信号超过 域值
通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家 基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对 表达量。
目的基因定量结果
公式： 校正值= 管家基因定量结果
相对值=
待测样品的校正值 对照样品的校正值
相对定量分析——双标准曲线法
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
齐全版(荧光PCR技术)ppt课件
实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
荧光定量PCR的原理及其应用PPT课件
操作复杂
荧光定量PCR的操作过程相对复杂， 需要专业人员进行操作。
荧光染料和探针的干扰
荧光染料和探针有时会对PCR扩增产 生干扰，影响结果的准确性。
样本中存在抑制剂的可能性
某些样本中可能存在PCR抑制剂，影 响荧光定量PCR的检测结果。
05 荧光定量PCR的发展前景
技术改进与优化
01
02
03
高效多重检测
合成新的DNA链。
的DNA链结合，产生荧
光信号，通过检测荧光
信号的积累，可以实时
监测DNA的扩增过程。
02 荧光定量PCR的种类
SYBR Green I法
原理
SYBR Green I是一种荧光染料，可以与双链DNA结合并发出荧光信号。在PCR扩增过程 中，随着DNA的合成，SYBR Green I荧光信号会逐渐增强，通过监测荧光信号的增强程 度可以实时监测DNA的合成。
通过荧光定量PCR技术，可以检测肿瘤组织中特定基因的 表达水平，从而评估肿瘤的恶性程度、转移风险和预后情 况。
在传染性疾病诊断中的应用
传染性疾病的病原微生物种类繁多，荧光定量PCR技术可以用于快速检测和鉴定 病原微生物，为传染性疾病的诊断提供准确依据。
通过荧光定量PCR技术，可以检测出病原微生物的核酸序列，从而确定传染性疾 病的病原体类型、感染部位和传播途径。
结合微流体技术和数字 PCR技术，实现单分子检 测，提高检测的灵敏度和 分辨率。
纳米材料增强
利用纳米材料增强荧光信 号，降低背景噪声，提高 检测的信噪比。
基因编辑技术
结合基因编辑技术，对基 因组进行定点编辑和改造， 为疾病治疗和基因治疗提 供新手段。
未来发展方向与展望
临床应用拓展
荧光定量PCR原理及应用 ppt课件
2020/12/17
SYBR Greeppnt课件I 工作原理
17
2020/12/17
ppt课件
18
2020/12/17
ppt课件
19
• 一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信
号的产生，随着循环数增加，荧光信号不
断积累。
2020/12/17
ppt课件
20
2020/12/17
ppt课件
21
• 模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和
2020/12/17
ppt课件
12
• 相对定量：是通过与内参基因Ct值之间的相
差来计算表达基因的差异，也称之为2 -ΔΔCt
•。
2020/12/17
ppt课件
13
2020/12/17
ppt课件
14
• 荧光定量PCR的理论基础：均基于荧光共振
能量转移（FRET)的原理，即当一个荧光基 团与一个淬灭基团的距离邻近时（＜10nm)， 就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧 光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使
其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭 基团分开，淬灭作用即消失。
2020/12/17
ppt课件
15
2020/12/17
ppt课件
16
• 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR
荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地 掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而 不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号 的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
• CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定
的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 。
2020/12/17
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
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