吉大农学部09生计工程复习资料(附答案) (1)

1、目前常用的转基因方法有哪些，各有何特点？
1、农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。

2、PEG法：
3、电击法：此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。

4、微针注射法：显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。

转化的成功率高
可以省去选择性标记的麻烦
5、基因枪法：是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。

在禾本科作物上应用较广泛。

基因枪法转化的优缺点：
无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。

而基因枪没有物种限制。

靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。

操作简单快速
但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。

应该说该技术只处在研究阶段，尚未成熟。

6、花粉管通道法：优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。

方法简便；单、双子
叶植物均可应用；育种时间短。

缺点：这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。

2、植物转基因受体材料有哪些？试述选择受体细胞的原则。

原则：
①据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择；
②重组体的转化或转染率高；
③能够稳定遗传；
④受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配；
⑤易于筛选重组体；
⑥外源基因可以高效表达和稳定遗传；
⑦此外，安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。

受体材料类型：（1）微生物表达系统（是较为理想的受体细胞）
常用微生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌、棒状杆菌和链霉菌、酵母菌（2）植物表达系统：
常用的受体材料有以下几大类型:愈伤组织再生系统、直接分化再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞受体系统
3、重组子的筛选和鉴定方法
一、载体表型选择法
（一）、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tet r和Amp r。

Tet r上有插入位点BamH I和Sal I; Amp r上有插入位点Pst I。

2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。

（2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。

（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。

3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tet r上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。

Tet r失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tet r不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。

（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Amp r上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。

（二）-半乳糖苷酶显色反应选择法
1、原理见简答
2、. 选择过程见简答
二、根据插入基因的表型选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。

（只在特定条件下）。

（一）原理：
1.弥补缺陷：转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。

2. 增加新性状：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。

三、DNA电泳检测法：利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。

（一）直接电泳检测法：从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。

（二）酶切电泳筛选法
1. 原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。

或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。

（三）PCR扩增检测法
1. 原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。

2. 过程：从重组克隆中提取质粒（或DNA），用外源DNA插入片断引物作PCR，电泳PCR产物，检查是否有PCR产物，PCR产物的长度是否与外源基因一致。

（四）核酸杂交检测法
1. Southern blotting ：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品，从宿主细胞中提取DNA （或质粒载体），再用探针杂交，只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。

2. Northern blotting：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。

主要检测插入片断是否被转录。

从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。

（五）免疫化学检测法：对表达产物的检测。

蛋白——蛋白“杂交。

利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。

A、放射性抗体检测法
B、免疫沉淀检测法：检测分泌型产物。

1. 原理：抗原——抗体凝集反应。

2、方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。

C、酶联免疫吸附测定（ELISA）
1. 原理：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。

D、免疫印迹（western blotting）法：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。

1.原理：
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。

将膜上的蛋白质转到膜上进行染色。

（2）Western blotting：电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上，blotting 原理与ELISA相同.
4、试从转基因植物本身的性质来分析基因工程存在的安全性问题。

转基因植物具有多样性,它能够增强对有害生物的耐受力，转基因植物本身及其转入基因在获得新基因后,对环境的忍耐力如耐除草剂、耐寒、耐旱、耐涝、耐污染、耐贫瘠土壤以及对有害生物的耐受性等方面,比非转基因植物强;增强对环境和对有害生物的耐受力;增强繁殖能力和生存力.狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指在分子水平上，提取不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源基因在受体细胞中进行复制和表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定遗传给下一代的技术。

随着植物转基因技术的逐渐成熟，在带给人们诸多方便的同时也带来了不少问题，包括：环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。

目前对于转基因工程的安全问题主要涉及一下几个方面：
1）人类、动物或植物受到寄生、受体或带菌生物的感染；
2）因转基因生物、其组份或代谢产物而产生的毒性或过敏反应；
3）由转基因生物所代表的产品产生的毒性或过敏反应；
4）因意外释放转基因生物而产生的环境影响；
5）产生更多具有传染性或抗药性的微生物；
6）将有害的基因物质（例如与癌有关的物质）通过转基因生物传给人类；
7）会侵占周围环境，替换掉已在该地长期生长的其他植物；
8）转基因植物中基因物质的转移，可能会转移至被认为是杂草的相关植物中，例如通过使其增加抵抗力而变得更具竞争性；
9）营养物质在环境中的自然循环受到转基因微生物的干扰等。

现代生物技术既有极大的推动生产力发展的一面，又有可能由于没有慎重使用这种技术，而对人体健康和环境造成危险的一面。

我们可以相信，随着科学的发展和完善，人类是可以解决转基因生物带来的安全性问题的。