Imageproplus使用指南.

Imageproplus的主要用途是分析测量图象。

1.基本操作2.AOI技巧3.AOI技巧续4.编制宏操作5.计数6.校正标尺7.几何测量8.图象分析策略9.其他有趣的功能10。

讨厌的光密度11.免疫组化光密度图片的测量12.免疫组化光密度图片的自动测量13.荧光照片的测量14.双染料染色照片的合成方法打开ipp后的界面是这样的，该从何处下手呢?这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI是IPP中最有用最重要的概念。

然而在选择AOI之前必须转换图象intensity格式。

校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。

将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。

在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。

而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。

如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。

转换光密度单位的方法如下:点击:measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口。

然后在窗口中点new 按纽，再点一下下面的std optical density选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。

然后还要点一下最上面的system按纽。

最后点close关闭窗口。

这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。

然后就是如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。

可以说，使用IPP的要点就是灵活地使用各种AOI工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。

对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，先用最简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说，用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。

点击measure---count/size,弹出分类测量窗口。

在窗口中选中manual,再点击select color,弹出颜色选择窗口segmentation,这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一。

用好这个工具是使用IPP的要点。

对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的。

点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。

在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。

用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。

下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。

图片中被标上红色的区域被定义为一个class,其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。

以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object。

选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就可以对选中的object进行测量操作了。

点击count/size窗口中的measure菜单，点select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有:area面积、density(mean)平均光密度、diameter直径、IOD(integrated optical density)累积光密度。

在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。

如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。

选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。

分别点击count/size窗口中view菜单中的measurement data和statistics，就分别弹出这两个数据窗口。

前者是这个calss中每一个object的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。

本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。

统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object的数目。

测量数据转入EXCEL处理起来最方便。

只要在数据菜单中点file - DDE to EXCEL。

数据就传到EXCEL的sheet1里去了。

在这个示例图片的统计数据中samples为图中所有细胞核的个数。

第一列为area,其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。

但IOD却是SUM值更有意义。

AOI技巧在IPP中，最有特色，最有用处的工具有两个。

一个就是我们已经看过的segmentation 工具，另一个是irregular工具。

我们先看irregular工具。

这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。

图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。

这就可以用到irregular工具了。

在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽，就调出了irregular工具条。

这个工具的标题叫Magic wand，就是photoshop中的魔棒呀。

将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。

这里"相似"的定量范围由Range的值来决定。

较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。

较小的range值则为较小的灰度范围。

在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。

最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。

点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。

smooth值是用来平滑区域边界的。

一般不需要平滑，因此默认值为零。

选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域（最后点一次右键），不能直接点选，要先点击一下工具栏上的Multiple AOI按纽，再点击add，接下去就可以到另一个选择区域点选。

选好一个新的区域后再回去点Multiple AOI--add确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。

最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。

结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下newAOI按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。

这个irregular工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个trace按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。

这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个AOI。

第一种是手画法。

确认工具条右边的Auto选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。

用鼠标画当然是不会准确的。

实在没别的招了才会出此下策。

第二种方法是自动寻迹。

把那个Auto给选上，speed值给减到1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。

这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个AOI。

重复选取多个AOI的方法与楼上一样。

如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。

可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。

这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。

最后点一下右键围成一个闭合的AOI。

围好的AOI边界是绿色框。

自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的。

选好了一个个的AOI后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦。

下面该怎么作呢?点开count/size窗口，点菜单EDIT---convert AOI to Objects.这样就把刚才选中的一个个AOI变成了要测量的object了，那些小区域的颜色也由AOI绿色外框线变成了object的标记了。

object的标记类型是可以自己设定的。

在count/size窗口右边有一个option按纽，点开它就能设定object标记的外观了。

在option窗口中，outline style可以选outline(轮廓线)或filled(填充class颜色)。

label style 可以选择为object序号或测量值。

再下面是label的文字颜色。

右上角还有一个class的颜色选择按纽。

下一步是点measure菜单下的select measurements。

选上要测量的项目。

注意，选完后要点击这个菜单中的measure按纽(而不是count/size窗口中的count按纽)。

然后是OK按纽关闭measure窗口，点开view菜单下的measurement date和statistics数据窗口。

几个object 的测量数据就已经在里面了。

如果你还想继续增加objcet，可以直接用irregular工具画AOI，然后点convert AOI to object。

这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的object测量数据会立即被更新。

在上一主题中讨论的主要是irregular工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的。

而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具了。

实际上，在第一部分入门中所用的就是segmentation工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。

如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。