三基因工程载体PPT课件
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基因工程第三章
由pSC101派生来的载体。
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
➢特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
➢适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个 。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
基因工程第三章
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的
第三章 基因工程载体
基因工程第三章
1. 载体 （Vectors）
➢定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
MCS
ori
pUC
遗传标记 Ampr
基因工程第三章
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。 （2）有选择性标记。 （。3）多克隆位点：供外源基因插入的限制酶位点 （4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。 （5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性 （7）具有较好的安全性，不能任意转移
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
基因工程第三章
三、质粒载体的构建
基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
基因工程-载体
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程第五章-载体
第一个经改造的认为 较完善的质粒载体是 pBR313, 他是松弛型 载体，引入了两个标 记基因------抗四环素 基因Tecr和抗青霉素 基因Ampr, 他的外源 基因插入位点在两个 抗性基因中
质粒的序列含有必要区和非必要区。
必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对 质粒的存活、复制极为重要。
❖ 对于天然质粒来说，他们的基因中含有控制质粒分配的功能 区，细胞分裂构成中，这个功能区保证质粒拷贝被平均分配。
❖ 人工构建的质粒这个功能区已经缺失，因此，它在细胞分 裂中是随机分配的，尽管出现无质粒的细胞的几率较低，但 在一定的条件下，比如――－细胞分裂较快或营养缺乏的情 况下，会出现无质粒的细胞。
❖ COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇 怪的蛋白质抗菌物质――大肠菌素。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
3. 引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载体：
构建质粒可用于组织化学方法的鉴定：pUC18载体带有 一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的基 因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现β－半乳 糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操作 子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查重组子。
Section one
plasmids
一、质粒的生物学特性：
❖ 质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双 链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并 保持遗传恒定的复制子，大小在1――200KB。质粒 常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性 基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微 生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
C3-1 基因工程的载体
3.1.1 质粒的基本特性
3.1.1.1 质粒DNA的复制 3.1.1.2 质粒的拷贝数 3.1.1.3 质粒DNA的不亲和性或不相容性 3.1.1.4 质粒的转移和迁移 3.1粒和隐性质粒
作为工程载体必备的条件
• 有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合 到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 • 具有多个单一的限制性内切酶酶切位点。 • 具有筛选转化子的选择性标记基因。 • 拷贝数高 • 分子量要小 • 安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转 入受体细胞以外的其它生物细胞中。
粒与其衍生的重组质粒。
质粒的不亲和现象（plasmid incompatibility）
子细胞中只 含一种质粒
3.1.1.4 质粒的转移和迁移
接合质粒(conjugative plasmid)：
• 指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效 地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受 体细胞。 • 分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、 较不安全。如：F质粒和Ti质粒等。
• 质粒DNA一般有三种构型：
超螺旋共价闭合环形(cccDNA, covalently closed circular DNA) 开环(oc-DNA, open circular DNA) 线性(L-DNA, linear DNA)
3.1.1 质粒的基本特性
3.1.1.1 质粒DNA的复制 3.1.1.2 质粒的拷贝数 3.1.1.3 质粒DNA的不亲和性或不相容性 3.1.1.4 质粒的转移和迁移 3.1.1.5 质粒的重组性 3.1.1.6 显性质粒和隐性质粒
F因子带动ColE1非结合质粒转移的条件
bom+
3.1.1.5 质粒的重组性
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程的载体和受体
2021/4/8
Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the
1919
（2）一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori：控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起 始点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
抗生素抗性基因：便于对目的基因的检测，如Amp、Kan。 多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段。 P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子。 T（Terminator）：终止信号。 poly(A)加尾信号：稳定mRNA。
2021/4/8
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（1）质粒改造策略
删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片 段的装载量。 灭活某些质粒的编码基因。 加入易于识别的选择标记基因。 选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列--多克隆接头(Polylinker)。 加入特殊的基因表达调控元件。
2021/4/8
2021/4/8
1111
（4）携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
2021/4/8
2021/4/8
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（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例：
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
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第三章 基因工程载体
基因克隆载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。
基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径 能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞， 并在其中得以维持的DNA分子。
以大肠杆菌的质粒为例：
• ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的DNA分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的 形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环DNA分子（oc-DNA）或线形 DNA分子（l-DNA）。
在变性条件下，质粒可成为单链DNA 分子（ss-DNA）。
至少有一个复制起点，因而至少可在一 Pvu I
种生物体中自主复制。
Pst I
至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。
克隆载体必须是安全的。
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
质粒DNA分子大小1-100Kb以上。
质粒DNA的复制
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；
既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型：
• 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid
“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆 载体。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则
• 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 • 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 • 组装合适的选择标记基因。 • 选用合适的启动子。 • 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构
• 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 • 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略
1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体DNA分子合适的位置有一至 多个克隆位点，供外源DNA片段组入克 隆载体DNA分子。
• 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、 R的其它成员
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型 质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因， 这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
控制复制起始因子与复制起始位点（oro
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质 粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗 性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的 质粒pMB3(13.3Kb)。
pMB3EcoRI* 大肠杆菌
AATT黏性末端环化 pMB8(2.6Kb)
载体的功能及特征
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
• 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
Origin of Replication Hind II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。•
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
pBR322的构建是质粒载体构 建的一个典范。
pBR322的亲本质粒
• pSF2124，含有Amp抗性基因 • pMB1，含有松弛型ColE1的复制
起点（ori） • Psc101，含有Tet抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
基因克隆载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。
基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径 能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞， 并在其中得以维持的DNA分子。
以大肠杆菌的质粒为例：
• ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的DNA分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的 形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环DNA分子（oc-DNA）或线形 DNA分子（l-DNA）。
在变性条件下，质粒可成为单链DNA 分子（ss-DNA）。
至少有一个复制起点，因而至少可在一 Pvu I
种生物体中自主复制。
Pst I
至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。
克隆载体必须是安全的。
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
质粒DNA分子大小1-100Kb以上。
质粒DNA的复制
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；
既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型：
• 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid
“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆 载体。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则
• 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 • 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 • 组装合适的选择标记基因。 • 选用合适的启动子。 • 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构
• 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 • 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略
1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种
3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体DNA分子合适的位置有一至 多个克隆位点，供外源DNA片段组入克 隆载体DNA分子。
• 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、 R的其它成员
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型 质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因， 这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
控制复制起始因子与复制起始位点（oro
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质 粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗 性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的 质粒pMB3(13.3Kb)。
pMB3EcoRI* 大肠杆菌
AATT黏性末端环化 pMB8(2.6Kb)
载体的功能及特征
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
• 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
Origin of Replication Hind II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。•
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建
pBR322的构建是质粒载体构 建的一个典范。
pBR322的亲本质粒
• pSF2124，含有Amp抗性基因 • pMB1，含有松弛型ColE1的复制
起点（ori） • Psc101，含有Tet抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建