HPLC法测定灵芝孢子红景天胶囊中红景天苷含量

药物研究The medicine studyHPLC法测定灵芝孢子红景天胶囊中红景天苷含量徐万帮蒋忠军广东省食品药品检验所，广东广州510180【摘要】目的：对灵芝孢子红景天胶囊中主要活性成分红景天苷含量进行测定。

方法：以红景天苷为指标，采用HPLC法，测定灵芝孢子红景天胶囊中红景天苷的含量，采用C18色谱柱（4.6mmˑ250mm，5μm）；甲醇：水（15ʒ85）为流动相；检测波长275nm；流速为1.0ml/min；进样量10μl。

结果：红景天苷在0.005 5.4mg/ml浓度范围内峰吸光度与浓度呈良好的线性关系（Ｒ=1），平均回收率为回收率在97.1% 108.9%。

结论：本方法简便可行，准确可靠，可用于制剂的质量控制。

【关键词】红景天苷；高效液相色谱法；高效液相色谱法；含量【中图分类号】Ｒ284.2【文献标志码】B【文章编号】1007－8517（2015）01－0034－03灵芝孢子（Ganoderma lucidium spore）是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，富含多糖，三萜类化合物，维生素C、E，胡萝卜素等多种生理活性物质，具有抑制肿瘤、免疫调节等作用［1］。

红景天则含有苷类、黄酮类、香豆素类、氨基酸类、鞣质、挥发油等多种化学成分，具有增强免疫力、抗辐射、提高缺氧耐受力、缓解体力疲劳、抗氧化等作用。

灵芝孢子红景天胶囊是以灵芝孢子粉、灵芝提取物、红景天提取物、淀粉、葡萄籽等为主要原料制成的保健食品［2］。

随着人民生活水平的日益提高，对保健食品的需求在未来一段时间内都会持续增长，目前国内有少量企业生产灵芝孢子红景天胶囊，为了更好的控制该胶囊的质量，本实验以香港某公司提供的灵芝孢子红景天胶囊为基础，以红景天苷为质量指标，采用高效液相色谱法测定红景天苷来检测灵芝孢子红景天胶囊中主要成分红景天的含量［3－5］，以期为灵芝孢子红景天胶囊的质量控制提供了有效地技术支持。

1仪器和试药实验仪器：美国安捷伦1200液相色谱仪（带自动进样器，DAD检测器等）；试药：灵芝孢子红景天胶囊（香港某公司，批号为20130901 3）；红景天苷对照品（批号为110818－201005，由中检所提供）。

甲醇购自默克公司，色谱纯，其他试剂为分析纯，去离子水为实验室自制。

2方法与结果2.1供试品溶液的制备2.1.1提取方法的选择超声法：取灵芝孢子红景天胶囊（批号20130903）适量，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理（功率120W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，作为供试品溶液。

回流法：取供试品（批号20130903），按超声法操作，将“超声30min”改为“回流30min”，其余同超声法制备。

取上述两种溶液，分别取10ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1。

表1不同提取方法的试验结果（n=3）提取方法回流法超声法含量（mg/g）10.4312.57从表1可以看出，采用超声法测定结果高于采用回流法，这是超声萃取的效率高于传统的加热回流。

2.1.2提取溶剂的选择为了获得最优提取溶剂，本实验根据红景天苷的溶解特性，分别采用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇作为溶剂进行提取。

取灵芝孢子红景天胶囊（批号20130903），照3.1.1法中超声法，分别用水、稀乙醇（50.0%）、甲醇进行提取制备供试品溶液，分别测定样品中红景天苷的含量。

结果见表2。

表2不同溶剂试验结果（n=3）溶剂水稀乙醇（50.0%）甲醇含量（mg/g）8.2110.4712.57从表2可以看出甲醇的提取效率高于稀乙醇、水。

这是由于红景天苷更易溶于甲醇。

2.1.3提取时间的选择为了获得最优提取时间，取灵芝孢子红景天胶囊（批号20130903）3份，以甲醇为提取溶剂，按超声法，分别超声处理15min，30min，60min，制成供试品溶液，分别测定红景天苷的含量。

结果见表3。

表3提取时间对红景天苷含量的影响（n=3）提取时间（min）153060含量（mg/g）9.2212.5710.38从表3可以看出，随着超声时间的延长，样品溶液中的红景天苷浓度缓慢增加，到30min左右达到峰值，随后逐渐降低。

可能原因是超声15min时样品中红景天苷提取不完全。

在超声30min到达峰值后，继续超声提取，导致红景天苷分解。

因此选择30min作为本品提取时间。

综上，灵芝孢子红景天胶囊中红景天苷的最佳提取方法为：取本品约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，即得。

2.2对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥过夜的红景天苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml约含5mg的溶液，其他浓度的对照溶液，采用稀释法稀释制备，各浓度对照溶液冷藏，备用。

·43·中国民族民间医药Chinese journal of ethnomedicine and ethnopharmacy药物研究The medicine study2.3色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器，以甲醇－水（15ʒ85）为流动相；检测波长为275nm ，流速为1.0ml /min ，柱温35ħ，进样量10μl ，以外标标准曲线法定量。

2.4方法专属性精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10ul ，注入HPLC ，记录色谱图，由色谱图1－3提示，在对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，空白溶剂（流动相）在此峰位置无吸收，对本品中红景天苷含量测定没有干扰，方法专属性良好。

2.5标准曲线的绘制精密量取浓度约为5mg /ml 的红景天苷对照品溶液100、10ml 、2和1μl 至10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列梯度溶液。

分别精密吸取10μl ，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定，记录色谱图。

以对照品的浓度（mg /ml ）为横坐标（x ），测得的峰面积为纵坐标（y ），绘制标准曲线。

得回归方程：y =2817.x －26.86，r =1。

结果表明，红景天苷对照品浓度在0.005 5.4mg /ml 之间与其峰面积呈良好的线性关系。

2.6精密度试验精密吸取浓度为0.54mg /ml 的红景天苷对照品溶液10μl ，注入液相色谱仪，重复连续进样6次，测定红景天苷峰面积，此时，红景天苷峰面积的ＲSD =0.18%，表明仪器精密度良好2.7稳定性试验精密量取同一红景天苷对照品溶液，分别在0，8，16和24h 按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定红景天苷峰面积，此时红景天苷峰面积的ＲSD =0.57%，表明红景天苷对照品溶液在此条件下稳定性良好。

2.8重复性取同一批供试品（批号20130903）6份，参照上述提取方法，按含量测定方法测定，记录峰面积，计算含量，此时该批号灵芝孢子红景天胶囊中红景天苷的含量为12.97mg /g ，ＲSD =0.93%（n =6），表明该方法重复性良好。

2.9回收率测定取同一批已知含量（批号20130903）的供试品6份，按照样品含量的100%将红景天苷对照品溶液加入到样品中，依上述最优提取条件进行提取，制备回收溶液，注入高效液相色谱仪，每份重复进样2次，共12次，记录色谱图，计算回收率。

结果见表4。

表4回收率试验结果（n =2）序号样品量回收率（%）平均值（%）1 1.0022106.972 1.0015108.853 1.001897.144 1.001999.645 1.0012103.1861.0012105.22103.52.10样品测定实测样品3个，每个2份，共计6份，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用标准曲线法计算红景天苷含量。

结果见表5。

（下转第38页）·53·中国民族民间医药Chinese journal of ethnomedicine and ethnopharmacy药物研究The medicine study间的环境差异及个体间的小环境差异对青叶胆生长过程中的形态变化产生了很大的影响。

3讨论青叶胆自上世纪70年代从开远、弥勒等地民间发掘出来后，随着青叶胆药用价值的发现，经过近20年的滥采滥挖，加上生境不断丧失和遭到破坏（如道路建设、开荒、开发沙场等），青叶胆在本课题组调查的所有区域中均呈星散残余分布，多数生长在临时或半临时生境，分布区域已渐成“岛屿状”，片断化明显。

本文研究结果表明，在所调查的5个青叶胆自然居群中，植株高度、个体分枝数、叶片长度、花梗长度和子房长度在居群内和居群间均存在不同程度的变异，表现为居群间变异大，而居群内个体间变异小，推测生境片断化后中，把青叶胆原有自然连续分布的居群分割成彼此隔离的小居群后，一来在不同程度上割断原居群个体之间的基因流；二来使片断化居群个体数量减少，这些都增大了片断化居群个体之间近交和自交的概率，各片断化居群间可能发生一些形态上的分化；另一方面，随着片断化居群之间隔离时间的增加，各隔离居群之间生物学特性发生变化（如植株花部形态性状和开花时间），导致即使有居群间的基因流，也无法进行居群间正常传、授粉，使隔离居群在遗传的分化越来越大，而首先就表现在形态性状上的变异。

青叶胆5个自然居群间的环境差异也是造成其形态性状发生变异的原因之一。

小苍窝和布龙坡居群相距较近，人类活动较少，种植了较少的坡柳Salix myrtillacea ，其遮蔽度较小、光照充足，土壤大多为砂岩，土质较暖，这2个居群植株生长良好，居群结构相对合理、稳定；因此在所调查的5个形态性状中，小苍窝和布龙坡居群植株的变异系数相对来说要小。

而绿水村、习岗哨和猴街居群内环境异质性较大，局部地段种间竞争明显，个体间小环境的差异也较大，因此这3个居群在形态性状上的变异可能是居群间和居群内环境异质和种间竞争共同作用的结果。

植物的形态性状是由其内在的基因型与所处的外界环境共同作用的结果，因此来自内在和外在因素的综合作用可能是青叶胆居群间形态性状发生极显著差异的主要原因。

青叶胆表现出来的形态变异，是其长期适应不同环境的结果，形态上的多样性和可塑性是青叶胆赖以适应和生存的基础。

参考文献［1］Stebbins GL．Ｒelationships between adaptive radiation ，speciation and major evolutionary trends ［J ］．Taxon ，1971，20（1）：3－16．［2］邢毅，赵祥，董宽虎，等．不同居群达乌里胡枝子形态变异研究［J ］．草业学报，2008，17（4）：26－31．［3］葛颂，洪德元．遗传多样性及其检测方法．见：钱迎倩和马克平（主编）生物多样性研究的原理和方法［M ］．北京：中国科学技术出版社，1994：123－140．［4］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志（62卷）［M ］．北京：科学出版社，1988：392．［5］何仁远，聂瑞麟．青叶胆植物中的红白金内酯和青叶胆内脂的结构［J ］．云南植物研究，1980，6（3）：325－328．［6］宋万春．龙胆科．见吴征镒主编：新华本草纲要（第2册）［M ］．北京：科学出版社，1991：387－402．［7］杜荣骞．生物统计学［M ］．北京：高等教育出版社，1999：10－23．［8］虞泓，郑树松，黄瑞复．云南松居群雄球花多态性研究［J ］．生物多样性，1998，5（6）：267－271．［9］虞泓，徐正尧，杨彩云．云南松居群花粉形态多态性［J ］．云南大学学报（自然科学版），1999，21（2）：86－89．（收稿日期：2014.11.02檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾）（上接第35页）表5样品测试结果表批号样品量（g ）峰面积计算含量（mg /g ）平均值ＲSD （%）201309031.00413532.6231912.9720130903 1.00073563.1964813.1213.050.93201309010.99203700.1435513.7520130901 1.00503629.8327613.3113.75 2.2420130902 1.00253502.5808112.88201309021.00373335.4797412.2512.883.455结论本实验采用甲醇为提取剂，用超声萃取的方法提取灵芝孢子红景天胶囊中的红景天苷，提取效率高，具有良好的操作性。