第一章酶学与酶工程1

第二节
酶的分类、组成、结构特点和作用机制
一、酶的分类 分类的依据：催化的反应
分类的层次：
大类，催化的反应类型（6大类）；
亚类，催化的底物中被作用的基团或键的特点；
亚亚类，亚类中的小类； 序号，表示酶在亚亚类中的排号。 编号方法：EC a.b.c.d（EC 3.4.21.4,胰蛋白酶） EC为国际酶学委员会缩写, a,b,c,d为在分类中各层次 的编号。
•转换数指的是当酶分子被底物完全饱 和时，每个酶分子在每秒钟将多少底 物分子转换成产物。其在数值上等与 k3（ k3也被称作kcat）。
第四节 蛋白质、酶和重组蛋白的分离纯化
一、蛋白质的大规模分离纯化
“大规模” ：作为商业出售的蛋白质制品， 至少要有数十克或数百克，乃至达公斤以上。 这里讨论的方法适于使用10～50kg的起始材料， 因为这个规模正好反映出实验室规模和工业规 模的主要差别。
酶 与 底 物 相 互 诱 导 ， 发 生 形 变 断 裂
底物与酶的邻近效应和定向效应
邻近效应：酶与底物结合形成中间复合物后，使 酶的催化基团邻近底物，使有效浓度极大提高， 从而反应速率大大提高。有人曾测过某底物在溶 液中的浓度为0.001moll-1而在活性中心的浓度 100moll-1，比溶液中的浓度高十万倍
活性中心为疏水区域
① 广义的酸碱催化
（狭义酸碱催化）
②共价催化 共价催化就是底物与酶以共价方式形成中间物。
亲核原子对底物的亲电子原子的攻击
所谓亲电试剂就是一种试剂具有强烈亲和电子的原子中心。带 正电离子如Mg２+与NH４+是亲电子的，含有－C＝O及一C＝N 一基团的化合物也是亲电子的
亲核试剂就是一种试剂具有强烈供给电子的原子中心。 酶的催化基团如丝氨酸的-0H基团，半胱氨酸的－SH基团 及组氨酸的一CH—N＝CH一基团。
大规模释放细菌蛋白质 最常用的是剪切法。 Manton—Gaulin匀浆器， Dyno—Mill球磨机。 二者每小时均可破碎100kg细菌细胞糊。球磨 机的显著优点是，可在封闭体系中安全破碎致 病菌或遗传工程菌。调查表明，使用Manton— Gaulin匀浆器大规模破碎细胞是最普及的。
（二）分离和浓缩
3.1 作用酯键
3. 水解酶 Hydrolases
3.2 作用糖基
3.3 作用醚键
3.4 作用肽键 3.5 作用肽键之外的C-N键 3.6 作用酸酐键 3.7 作用C-C键
3.8 作用卤素键
3.9 作用于P-N键 3.10 作用S-N键 3.11 作用C-P键
4. 裂解酶 Lyases
4.1 C-C裂解 4.2 C-O裂解 4.3 C-N裂解 4.4 C-S裂解 4.5 C-卤素裂解
5）1913年Michaelis Menton根据中间产物学 说提出了酶促反应动力学原理—米氏学说。
6） 1926年，Sumner从刀豆中得到脲酶结晶， 提出酶本身就是一种蛋白质。 7）20世纪50-60年代，发现酶有相当的柔性， 因而Koshland提出了“诱导契合”理论。 8）1982年Cech小组发现，四膜虫的rRNA前体 能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工， 催化得到成熟的rRNA产物。就是说，RNA本身 是生物催化剂，称其为“Ribozyme”
（三）根据酶的存在状态分为：胞内酶、胞外酶 1.胞内酶： 在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数 的酶属于此类。 2.胞外酶： 在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。
胞 内 酶 存 在 状 态
三、酶的作用机制
1、中间产物学说
S + E 底3; E 产物
中间产物
① 双水相的形成： 将两种不同水溶性聚合物的水溶液 混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分 成互不相容的两相，构成双水相体系。 聚乙二醇(PEG) ／葡聚糖（Dextran)和PEG／磷酸盐体系 ② 萃取原理： 分配。 利用生物物质在双水相体系中的选择性
1. 氧化还原酶 Oxidoreductases
1.1 作用于CH-OH（供体）
1.1.1 以NAD+或NADP+为受体 1.1.2 以细胞色素为受体 1.1.3 以氧为受体 1.1.99 其它受体
1.2 作用于醛基或酮基
1.3 作用于CH-CH
1.4 作用于CH-NH2
1.5 作用于CH-NH
1.6 作用于NADH或NADPH
9）1983年Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA部分 具有催化活性，该酶的蛋白质部分无酶活性 10） Cech、 Altman共同获得1989年的诺贝尔化 学奖 11）1986年，Schultz和Learner两个小组同时报 道了，用事先设计好的过渡态类似物作半抗原， 按标准单抗制备法获得了具有催化活性的抗体， 即抗体酶（Abzyme）。
2、诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接 近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，同时底物构 象也发生变化。这样就使酶活性中心有关基团正确排列和 定向，使酶与底物完全契合而结合成中间产物并引起底物 发生反应。
3、酶的催化作用
可能来自五个方面，即
广义的酸碱催化、 共价催化、 邻近效应及定向效应、 变形或张力
2、 酶学及酶工程研究历史 （1）酶学研究历史 1）19世纪中叶，巴斯德（Pasteur）对酵母 的乙醇发酵进行研究 2）1878年 Kuhne首先把酵母中进行乙醇发 酵的物质称为Enzyme
3）1896年Buchner兄弟发现无细胞抽提液也 能将糖发酵成乙醇 4）1902年Henri提出中间产物学说
4.6 P-O裂解
4.99 其它裂解
5. 异构酶 Isomerases
5.1 消旋酶和差向异构 5.2 顺反异构 5.3 分子内氧化还原酶 5.4 分子内转移酶 5.5 分子内裂解酶
5.99 其它异构酶
6. 连接酶 Ligases
6.1 生成C-O键
6.2 生成C-S键 6.3 生成C-N键 6.4 生成C-C键
由四个部分组成：
(1)酶的产生；
(2)酶的分离纯化
(3)酶的固定化
(4)生物反应器。
酶工程
｛
化学酶工程：自然酶、化学修饰酶、固定 化酶及化学人工酶的研究和应用 生物酶工程：（1）用基因工程技术大量 生产酶(克隆酶)； (2) 修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)； (3) 设计新的酶基因合成自然界不曾有的 新酶。
⑤ 酶的活性中心为疏水区域 酶的活性中心常为酶分子的凹穴。此处常为非极性 或疏水性的氨基酸残基。疏水区域的特点是介电常数 低，并排出极性高的水分子。这使得底物分子的反应 键和酶的催化基团之间易发生反应，有助于加速酶催 化反应。
第三节
一、米—曼氏模式
酶动力学和抑制作用
Vmax S v K m S
酶工程
（Enzyme Engineering）
第一章 酶学与酶工程
第一节 酶工程概述
1.酶工程概念
酶工程（Enzyme Engineering）是利用酶的催化 作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化 工技术结合而形成的新技术，是借助工程学手 段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品 的一门科学。 酶工程主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用
（一）、蛋白质的来源及释放
对于大规模纯化来说，以微生物作为来源为好 1、微生物含有很多哺乳动物中没有的有用蛋 白质和酶制品、 2、可以采用微生物遗传较容易地筛选出新的 高活力蛋白质和酶制品；
3、细菌可以任何规模生产，这就保证了供应的连 续性；利用遗传工程方法可在细菌中高水平表达所 需要的蛋白质和酶。 4、胞外微生物蛋白质和酶可以很容易从发酵液中 分离出来，并能用最少的步骤纯化成便于使用的状 态。它们通常是非常稳定的低分子量蛋白质。 5、很多有用蛋白质和酶是在胞内的，要用较复杂 的技术才能纯化它们。
4）1969年日本千钿一郎首先在工业上应用固定化氨基酰化酶 拆分DL氨基酸获得成功。从此开始用‘酶工程’代表酶的生 产和应用 5）1971年，第1次国际酶工程会议在美国召开，会议主题是 固定化酶 6） 1980年，Wagner等人报道，将大肠杆菌ACTTlll05的青霉 素酰化酶基因克隆到质粒上，获得产酶活力更高的大肠杆菌 5K(PHM12)杂交株，并将此大肠杆菌杂交株固定，用于生产 青霉素酰化酶。这是基因工程与酶工程相结合的第一例。 7）1984年Klibanov等人进行了有机介质中酶的催化作用研究
RCF＝1.119×10-5×r×（r/min）2
角式离心机和离心头（转子）
2、过滤： 过滤是从细胞抽提物中除掉固体的另一种方式。 涡流膜过滤法(cross-flow membrane filtration)，它可以代替 离心法。用此法所得之滤液之比活，比用离心法得到的上 清液比活要高，而且所需时间短，投资也显著降低 ３、双水相体系萃取法 该技术是近年涌现出来的具有工业 开发潜力的各种新型分离技术之—，
（2）酶工程研究历史 1）1908年，德国罗姆（Rohm）等利用胰酶 使皮革软化 2）1949年，日本采用深层培养法生产α-淀粉 酶获得成功，使酶制剂生产应用进入工业化 阶段 3）1959年，由于采用了葡萄糖淀粉酶催化淀 粉生产葡萄糖新工艺研究成功，彻底革除了 原来葡萄糖生产中需要高温高压的酸水解工 艺，并使淀粉得糖率从80％上升为100%，致 使日本在1960年葡萄糖产量猛增10倍。
1.97 其它氧化还原酶
氧化还原酶例
甘油醛磷酸脱氢酶，EC1.2.1.12 甘油醛-3-磷酸 + 磷酸 + NAD+ 1，3-二磷酸甘油酸 + NADH
2. 转移酶 Transferases
2.1 转移一碳基团 2.2 转移醛基或酮基
2.3 转移酰基
2.4 转移糖基 2.5 转移甲基以外的烷基或芳基 2.6 转移含氮基团 2.7 转移含磷基团 2.8 转移含硫基团
（二）根据酶的结构特点及分子组成形式分为： 1.单体酶 ：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶 属于此类。 2.寡聚酶：由相同或不同的若干亚基构成。 由几条或几十条多肽链组成，每条肽链是一个亚基， 单独的亚基无酶的活力。如己糖激酶、乳酸脱氢酶， 均含四个亚基， 谷氨酸脱氢酶含六个亚基。 3.多酶复合体： 若干个功能相关的酶形成特定的空间结构。每个单独 的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特 定的链式反应，如丙酮酸氧化脱羧酶复合体，含三个酶 六个辅助因子；脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一 个非酶蛋白质。
1、离心：大规模纯化需要工业用连续流动离 心机。
物质在离心机中停留的时间较短。转筒形离心 机所能达到的最高g值为16 000，设计的沉降 途程短，可容纳60kg固体。也可采用间歇卸料 的圆盘式离心机
（1）离心机转数(r/min)与相对离心力(RCF)的换算
r为离心机头的半径，或离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的 距离单位为厘米．r/ min为离心机每分钟的转速。 RCF为相对离心力，以地心引力即重力加速度的倍数来表示，一 般用g表示。 图2是由下述公式计算而来的：
6.5 生成磷酸酯键
分类编号的应用
查询：由分类号可上网或由酶学手册 （Handbook of Enzymology）查询相关信息： 专一性，米氏常数，最适温度，最适pH，等电 点，分子量等。
至1998年已有1998个酶列入手册：氧化还原 酶537，转移酶559，水解酶490，裂解酶231， 异构酶98，连接酶83。
1.7 作用于其它含氮化合物
1.8 作用于含硫基团 1.9 作用于血红素
1.10 作用于二酚类和有关物质
1.11 作用于过氧化氢 1.12 作用于氢 1.13 作用于单个供体并结合分子氧（加氧酶） 1.14 作用于一对供体并结合分子氧（羟化酶）
1.15 作用于过氧化物基团
1.16 作用于氧化的金属离子 1.17 作用于 -CH2-
论文或其它学术场合中涉及酶时，第一次提到 时应说明其分类编号。
二、酶的组成和结构特点
（一）根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、 多成分酶（结合酶）
酶的辅助因子
（1）.金属离子：常见酶含有的金属离子有K+、Na+、
Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。 （2）.小分子有机化合物：即一些稳定的小分子有机物质， 其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团。