啤酒微生物污染及检验技术

食品科技
啤酒微生物污染及检验技术
许景成，张玉娟，徐知明
（深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518102）
摘　要：如今，啤酒的生产环境和卫生条件已经得到大幅改善，且啤酒中的环境不利于微生物生长，但仍有少数微生物能够在啤酒中生存和生长，对啤酒的生产和啤酒的质量安全构成威胁。

其中，常见的微生物是革兰阳性菌、革兰阴性菌和野生酵母，这些微生物会对啤酒的口感及产品品质产生直接影响，且会给啤酒制造商带来严重的经济影响。

为了有效控制啤酒中的微生物污染，本文介绍了啤酒中常见的有害微生物及其检验技术，为提高啤酒质量提供参考。

关键词：啤酒；微生物；ATP生物发光检测技术；PCR技术
Beer Microbial Contamination and Detection Techniques
XU Jingcheng, ZHANG Yujuan, XU Zhiming
(Shenzhen Flux Testing Technology Co., Ltd., Shenzhen 518102, China) Abstract: Nowadays, the production environment and sanitary conditions have been greatly improved, and beer is not conducive to the growth of microorganisms. However, there are still a few microorganisms that can survive and grow in beer, posing a threat to the production and safety of beer. Among them, common microorganisms are gram-positive bacteria, gram-negative bacteria and wild yeast. These microorganisms have a direct impact on the taste and quality of beer, and can have a serious economic impact on brewers. In order to effectively control microbial contamination in beer, this paper introduces common harmful microorganisms in beer and their detection techniques, providing reference for improving beer quality.
Keywords: beer; microorganism; ATP bioluminescence detection technology; PCR technology
啤酒中含有一定量的乙醇，且具有高二氧化碳含量、低pH值和低氧气浓度的特点，被认为是一种微生物稳定的酒精饮料。

此外，糖化、麦芽汁煮沸、巴氏杀菌、无菌过滤和冷藏等加工条件也抑制微生物的生长，因此啤酒被认为不利于大多数微生物的生长[1]。

尽管啤酒存在上述不利于微生物生存的特点，少部分微生物仍能够在啤酒中正常生长繁殖，这些微生物通常被称为啤酒污染微生物，其会造成啤酒浑浊、形成沉淀或产生异味，严重影响啤酒品质和安全，对啤酒酿造行业产生非常不利的影响[2]。

因此，为了保证啤酒的质量，必须深入了解啤酒生产过程中的有害微生物，本文简要介绍啤酒中常见的污染微生物及常用的啤酒检测技术。

1　啤酒中常见的有害微生物种类及其危害
1.1　革兰氏阴性菌
1.1.1　醋酸菌
醋酸菌是需氧或微需氧菌，能够将乙醇氧化成乙酸。

最常污染啤酒的两个醋酸菌属是醋杆菌属和葡萄糖酸杆菌属。

醋酸菌在25～30 ℃和pH值为5～6的环境下生长最佳，但很多菌株仍能在pH值低于4时繁殖。

对于啤酒混合饮料的制造而言，葡萄糖酸杆菌经常存在于水果产品和软饮料中，葡萄糖酸杆菌污染不仅会导致乙酸香气和酸度更高，还会使啤酒表面形成薄膜，导致啤酒浑浊或黏度高。

1.1.2　发酵单胞菌
发酵单胞菌是过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、非孢子形成、兼性厌氧细菌。

它们耐乙醇浓度高达约10%，在pH值高于3.4和温度为25～30 ℃时生长最佳。

感染发酵单胞菌的啤酒，由于存在乙醛和硫化氢，会产生一种腐烂苹果的气味，进而演变成硫化物和腐烂鸡蛋的气味。

1.1.3　果胶杆菌
果胶杆菌被确定为啤酒变质的重要原因。

果胶杆菌在pH值3.5～8.0和15～40 ℃的环境下生长，最适pH值为6.5～7.0。

果胶杆菌可在乙醇浓度低
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154食品安全导刊 2023年2月（中）
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于5.5%的培养基中增殖，在缺氧的情况下，果胶杆菌会使啤酒严重恶化，尤其是酒精含量低、pH值高的啤酒。

啤酒中果胶杆菌的增殖速度较慢，这意味着只有在产品离开啤酒厂后才能检测到。

啤酒被果胶杆菌污染后会导致浑浊和类似臭鸡蛋的难闻气味。

1.2　革兰氏阳性菌
最常见的啤酒腐败微生物是乳酸菌。

乳酸菌是无孢子形成、杆状或球菌状、过氧化氢酶阴性的一种菌。

乳酸菌会产生乳酸，作为碳水化合物代谢的主要最终产物。

乳酸菌对啤酒厂构成严重威胁，因为其繁殖迅速，且耐高酸性和高温。

乳酸菌在4%～6%的典型乙醇浓度下，生长速度减慢但不能停止生长。

只有在大约10%的高乙醇浓度，才能完全抑制乳酸菌的生长。

乳酸菌污染能导致啤酒严重混浊、沉淀、变酸。

2020年，乳酸杆菌属被重新分类，大约有20种乳酸菌物种对啤酒有潜在危害，其中有3种是啤酒变质的最常见原因[3]。

（1）短乳杆菌。

短乳杆菌是一种兼性厌氧型乳酸菌，生长温度为15～45 ℃，最佳生长温度为30 ℃，pH值为4～5。

它是啤酒中所有乳酸菌中适应性最强的菌[4]。

由于其能够发酵淀粉和糊精，短乳杆菌的污染会导致浑浊的酸性啤酒中含有生物胺和高浓度乙醇。

（2）林氏果乳杆菌。

林氏果乳杆菌是第二常见的乳酸杆菌。

该物种具有强制性的杂发酵和微需氧性。

它在高达30 ℃和4.6～5.2的pH值下生长最佳。

林氏果乳杆菌对热处理非常耐受，它只能发酵葡萄糖、麦芽糖，在某些情况下还可发酵果糖。

据报道，林氏果乳杆菌可耐受高达7%的乙醇浓度，并能耐受非常高的啤酒花水平（45 IBU），啤酒花是啤酒中乳酸菌细菌的主要抑制剂[5]。

（3）足球菌。

足球菌是一种微需氧、同型发酵球菌状的乳酸菌，形成四分体、双球菌或短链。

它在8～30 ℃的温度下生长，最佳生长环境在22～25 ℃和pH值5.5。

足球菌在啤酒中会产生较大的危害，当啤酒在生产过程中受到其污染时，会有大量2,3-丁二酮产生，会延长啤酒发酵时间，出现黏性丝状混浊，导致变酸和变稠，从而影响啤酒的口感[6]。

1.3　野生酵母
细菌不是啤酒污染的唯一来源，野生酵母也会破坏啤酒。

在酿造中，野生酵母被描述为“没有故意引入并在酿造过程中不受控制地生长的酵母菌株”。

传统上，野生酵母分为酵母菌和非酵母菌。

酵母菌的污染是严重影响微生物稳定性的原因，由于该物种具有葡糖淀粉酶，可将糊精水解为单糖，因此会导致二氧化碳的超级衰减和异常高的浓度。

这可能导致啤酒离开啤酒厂数周后瓶子爆炸。

很多非酿酒酵母物种，无法在厌氧条件下茁壮成长，因此其不会对成品啤酒构成重大威胁。

野生酵母可从啤酒生产过程的各个阶段分离出来，它们被视为机会性污染物，在条件有利的情况下会导致腐败。

一般来说，在从成品中去除氧气的现代啤酒厂中，野生酵母不会构成威胁。

这些酵母在桶装发酵啤酒中更为常见，因为氧气的进入使它们能够生长[6]。

2　啤酒中常见的有害微生物检验技术
2.1　培养法
培养法是目前最常见的检测方法，具有方便、成本较低的优点，但培养法需要7 d左右的等待时间，时间成本高，同时特异性和准确度较低，且无法快速阻止生产过程中微生物的污染。

该方法有多种培养基，如UBA、MRS、NBB等。

NBB用于检测已知啤酒中所有的有害菌，并将啤酒添加到NBB培养基中以使营养素、矿物质和生长因子多样化，同时添加放线菌酮，抑制酵母菌生长速度。

UBA是一种常见的对乳酸菌及醋酸菌具有较好检测效果的培养基。

MRS培养基是用于富集培养乳酸菌所用培养基，通过添加过氧化氢酶以提高啤酒微生物的生长速度和菌落大小。

研究表明，改良的MRS培养基可在5 d内或更快速地检测出耐酸乳杆菌，包括生长缓慢的微生物。

此外，国外一些研究人员还研制出改良培养基（ABD），可用于检测对啤酒有害的乳酸菌，这些乳酸菌难以培养，且对乳酸菌具有较高的敏感度。

ABD培养基可选择性培养含有有害乳酸菌的啤酒，以抑制啤酒有害微生物的生长，与其他常用培养基相比，ABD培养基已经达到了快速检测和鉴定啤酒有害乳酸菌的目的[7]。

2.2　ATP生物发光检测技术
在正常条件下，基于三磷酸腺苷（ATP）的普遍存在，可通过ATP生物发光来快速量化微生物生物量。

检测ATP生物发光法的原理是当荧光素酶和Mg2+同时存在时，荧光素LH2和ATP活化后与氧气发生氧化反应，释放荧光，释放出的荧光强度和ATP的量成一定的比例关系，绘制出一条标准曲线同时据此对样品的微生物数量进行测定。

该技术适合在短时间内快速检测啤酒腐败菌，但理论上酵母的检测敏
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感度为1～100个细胞数，细菌为103～104个细胞数，但实际上，由于环境的干扰和影响，很难达到这个检验限度。

同时，该方法易被游离ATP等干扰，有时灵敏度达不到要求[8]。

2.3　聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外扩增特定DNA片段的技术，可检测出微量靶序列。

德国拜发公司开发了系列啤酒Real-time PCR有害微生物检测试剂盒，可在2～3 h内快速检测和识别出啤酒中的污染菌和破坏性菌，解决了使用传统方法检测周期长和检测结果延迟的问题。

因此，应用于啤酒中有害菌鉴定的PCR技术快捷准确且能预测啤酒中有害菌的变质能力，为生产提供及时的指导信息，具有较大的推广价值[9]。

但PCR检测方法只能通过核酸序列检测已知的微生物，因此有害细菌的检测不能同时确定提取的DNA是来自死细胞还是活细胞，导致PCR检测方法未能在啤酒行业得到广泛应用。

此外，PCR检测方法检测成本高昂，在定量方面有较大缺陷[10]。

随着技术的不断发展，PCR技术还能够同新技术进行有效结合，逐渐转变成新型聚合酶链式反应衍生技术，常见的有实时荧光聚合酶链式反应技术、多重引物聚合酶链式反应技术。

此外，很多研究人员通过实验发现，啤酒微生物中包含与菌种无关的抗啤酒花基因，且检测出其能够腐败啤酒，原因是这些基因能够通过单独或多重组合存在。

因此，为了获得更全面、更准确的啤酒微生物检测方法，需要研究更多啤酒微生物标记基因作为数据支撑，其方法就是通过对未知啤酒微生物进行全基因组测序和比对实验[11]。

2.4　荧光原位杂交技术
此方法结合了ATP依赖性生物发光和化学发光原位杂交方法。

使用过氧化氢酶标记的多肽核酸探针，该探针可特异性地结合rRNA序列。

通过将探针与核酸结合，荧光显微镜能够在不改变分析对象的情况下观察荧光信号且分析目标核酸。

荧光原位杂交技术除了可检测可培养的微生物，还可检测尚未培养（即不可培养）生物，了解复杂的微生物群落，具有灵敏度和特异性更高、检测时间更短的优点[11]。

3　结语
如今，啤酒的安全问题日益受到人们的关注，且随着啤酒越来越受人们喜爱，近些年来其市场需求日益增加。

鉴于此，本文介绍了啤酒中常见的有害微生物种类及其危害，同时分析了啤酒中常见有害微生物的检验技术，以检测和控制啤酒酿造行业中微生物的污染程度，确保啤酒的质量安全，促进啤酒行业的稳步发展。

参考文献
[1]KIM S A,JEON S H,KIM N H,et al.Changes in the microbial composition of microbrewed beer during the process in the actual manufacturing line[J].Journal of Food Protecti-on,2015,78(12):2233-2239.
[2]孙培龙,徐巧林,赵敏.啤酒中污染菌检测与鉴定的研究进展[J].酿酒,2006(6):65-69.
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[4]GARCIA-GARCIA J H,DAMAS-BUENROSTRO L C,CABADA-AMAY A J C,et al.Pediococcus damnosus strains isolated from a brewery environment carry the horA gene[J]. Journal of the Institute of Brewing,2017,123(1):77-80.
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