乙型肝炎病毒(HBV)实时荧光定量PCR

乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR
[目的要求]
掌握血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR的测定原理；HBV-DNA实时荧光定量PCR实验操作及结果分析
了解核酸测定引物设计原理；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作。

[教学时数]
讲授2学时，实验6学时。

[讲授内容]
血清中病毒DNA的提取方法和原理；实时荧光定量PCR的测定原理；核酸测定引物设计原理；HBV-DNA测定引物设计思路；HBV-DNA荧光定量PCR试剂组成、相应作用及反应混合液配制；实时荧光定量PCR仪的工作原理及操作
[实验内容]
分组提取血清中HBV-DNA；配制反应液并上机操作，实时观察，结果分析；实验结果讨论；实验总结
[自学内容]
“感染性疾病的分子诊断”
实验指导（自编）
实验乙型肝炎病毒（HBV）实时荧光定量PCR
【原理】
Real time PCR 是普通PCR 的一项改进，使用了针对扩增DNA 的荧光物质，使得DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA 的扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

即对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测。

该方法精确、灵敏、特异性强、污染途径小、自动化程度高、操作简单。

是国际公认的核酸分子
定量的标准方法。

它已逐渐代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技术。

本实验从HBV携带者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，采用核酸扩增结合TaqMan荧光探针技术, 利用一对乙肝病毒特异性引物和一特异性结合于扩增区另一位点的TaqMan探针, 实现对乙肝病毒模板的扩增和检测。

使用商品化试剂盒：HBV实时荧光定量试剂盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。

针对表面抗原S基因，设计一对引物和一个探针。

TaqMan荧光探针技术中，两个荧光染料标记在探针上，一个叫报告基团（R），一个叫淬灭基团（Q）。

当两个荧光基团都连在探针上时，报告基团的荧光被淬灭基团抑制。

在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把报告基团从探针上切下来。

一旦和淬灭基团分开，报告基团释放出荧光。

通过监测荧光信号的积累来反映乙肝病毒DNA的扩增.产物的积累，根据扩增反应的动力学特征使用外部标准曲线对初始模板定量（图4）。

图4：TaqMan荧光探针技术原理
R:荧光报告基团Q：荧光淬灭基团
【试剂与器材】
1．HBV-DNA检测试剂盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR预混合液（含有Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、荧光标记的探针）、Taq酶、UNG，强阳性对照血清、阴性对照血清、临界阳性血清，四种不同浓度的阳性参控品、双蒸去离子水。

2．荧光定量PCR仪
3．PCR反应管
4．移液器及移液器吸头
5．高速离心机
6．漩涡混合器
7．超净工作台
8．调温电热板
【操作步骤】
1. 试剂和主反应混合物的准备：从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG。

室温融化后，2000rpm离心10sec，设需要的管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个PCR反映管中分别加入38ul，转移至样本处理区。

2. 样本的制备和上样
（1）标本处理
取n个0.5ml灭菌离心管，做好标记。

首先加入100ulDNA提取液1，再分别加入待测血清或血浆样本（切勿吸入血细胞）以及各种对照品各100ul，振荡混匀，13000rpm离心10min：吸弃上清（离心时注意固定离心管方向，尽可能吸弃上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec（沉淀无需打散、混匀），100℃干浴，13000rpm离心10min，保留上清备用。

如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃。

（2）上样
若样本及对照品裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min。

在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和室内质控血清、灭菌去离子水以及阳性参控品各2ul，盖紧PCR反应管管盖，并记录样本信息。

3. PCR上机扩增
检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器；检查并消除反应管底气泡。

按设置装载反应管，选择或设置扩增和检测条件：选择预设的程序文件或设置为：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40个循环，荧光信号收集设在600C。

设置模板：设置孔位及荧光（详见相应仪器的操作手册）。

保存数据文件并运行。

4. 结果分析
（1）设置分析条件：
设定基线：不同的PCR仪操作略有不同，按仪器说明书操作。

①PE7700:分析前把标准荧
光定为TAMRA。

如果没有C t<16的强阳性样品，应选3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析C t；如果有C t<16的样品，则将此样品定为强阳性，并将此样品从数据库中剔除，然后以3～15个循环的平均荧光信号作为基线再分析C t。

②ICycler：基线一般取自设值（2~10）。

实验结束后，点击PCR baseline subtract选项扣除基线值。

若某些曲线出现无规则的起伏跳动，应视为非正常现象，此时将其从结果中剔除（点击select wells,消除此孔彩色，然后选择display wells）。

注意调整坐标，使所有曲线都在坐标内，见图5。

③LightCycler：用荧光显示模式F1/F2读取结果。

基线设定原则以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且C t值不出现任何数值时为准（一般定在0.001～0.01范围内，也可以根据仪器本身的实际情况加以调整）。

域值设定：以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，且阴性对照品C t=40或C t=0为原则，调整起始域值。

（2）实验有效性判断：检查质控和标准品应同时符合下列条件，见图5：（否则试验视为无效）
阴性对照、试剂空白CT值都为0
强阳性对照和室内质控CT值不为0，且强阳性小于室内质控，拷贝数在105~107间。

标准品CT值小于38，且标准曲线斜率在-3.5 ~ -4.0间，截距在40 ~ 50间，相关系数小于-0.98。

A.
B.
图5 实时荧光定量PCR结果分析
E8, F8, G8, H8为标准品，D8为待测样本，C8为阴性对照；
A：基线、域值设置，B.：标准曲线
5. 检测结果的报告：
检测样本中103copies/ml ≤HBV DNA ≤5×107copies/ml，可直接报告相应的拷贝数；检测样本中HBV DNA < 103copies/ml时，均报告为< 103copies/ml。

检测样本中HBV DNA 为0copies/ml时，报告为< 103copies/ml。

检测样本中HBV DNA > 5×107copies/ml时，均报告为> 5×107copies/ml
【注意事项】
1．操作中应使用不含荧光物质的一次性手套（经常更换）、一次性吸头（最好带滤芯），并不能用手直接接触扩增管。

2．操作台、离心机、移液器、PCR扩增仪等应定期用10%次氯酸钠或70%酒精擦拭去污染。

3．荧光探针应避光保存，配制好反应液体系，应尽快上机扩增。

4．配置反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有液体的混匀要使用振荡器进行，不能用移液器吹打。

5．所有试剂开盖前，应短暂离心。

6．配制反应体系过程中若需标记，请在试管或离心管架上标记，不要直接标记在扩增管上。

【思考题】
通常PCR有典型的变性-退火-延伸三个温度点，为何本实验扩增温度循环只有两温度点：950C：5sec，600C：30sec，40个循环？
1.一般典型阳性的扩增曲线有对数生长期（荧光信号呈指数上升，曲线平直且有一定斜率），以及平台期（荧光信号无明显上升，由于酶失活或dNTP耗尽等原因，曲线平直且与基线平行）。

2.而临界阳性标本的扩增曲线可能只有对数生长期。

（循环已经结束等原因）
3.阴性标本的扩增曲线一般无突起，始终为一直线。

（与基线平行）
4.而有些阴性扩增曲线由于仪器信号等原因，可能呈不规则性，（特点为荧光信号低，曲线无规则，无对数生长期，无平台期等）要与阳性扩增曲线区分。